受容体とカップルするADPリボシールシクラーゼ分子の個体レベルでの解析

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12480228
• 研究機関: 金沢大学
• 研究代表者: 東田 陽博 金沢大学, 医学部, 教授 (30093066)
• 研究分担者: 星 直人 金沢大学, 医学部, 助手 (90229170) ; 横山 茂 金沢大学, 医学部, 助教授 (00210633) ; 橋井 美奈子 金沢大学, 医学部, 講師 (10272957)
• キーワード: Caシグナリング / サイクリックADPリボース / Caプール / セカンドメッセンジャー / 信号伝達機構 / NAD / cADPR

研究概要

細胞内のCaをセカンドメッセンジャーとするCaシグナリングは、数多くの受容体の下流に存在する重要な信号伝達機構の一つである。最近、リアノジン感受性の細胞内Caプールを開く細胞内リガンドはサイクリックADPリボース(cADPR)であると考えられるようになってきた。この数年、我々はcADPRがIP3のようなセカンドメッセンジャーであるとするこの仮説を検証してきた。そしてNADからcADPRを産生する膜酵素が受容体によりコントロールされていることをムスカリン受容体を大量発現するNG108-15細胞(J.B.C.,1997)とβアドレナリン受容体を持つ心臓心室筋(J.B.C.,1999)を用いて始めて証明することができた。今年度はアメフラシのADPリボシルシクラーゼと相同性を持つことで知られるヒトCD38のcDNAをプローベとしてノーザンブロットをしたところニューロブラストーマNG108-15細胞ではシクラーゼのRNAは検出できなかった。また前実験としてラット大脳膜分画のADPリボシルシクラーゼ活性を測定したところ、NG108-15細胞のそれと同じ性質をもつ酵素活性を得た。従って、CD38以外の内在性のADPリボシールシクラーゼ(CD38とは全く別のタンパク質かまたはCD38の脳型アイソホーム)が存在している可能性があることがわかった。
1.ラット大脳(100g)あるいはNG108-15細胞(200フラスコ分)をタンパク分解酵素阻害剤の存在下でホモゲナイズし、105,000g15分の遠心により粗膜分画を得た。2.上澄みをプル-Aセファロースカラムにかけ0.5M NaClで洗った後、0.5M KSCNで溶出。3.次に,ヒドロキシアパタイトカラムにかけた。洗浄後0.1Mリン酸で溶出した。4.コンカナバリンA-セファロースカラムにかけ、0.5M methyl-α-glucopyranosideで溶出。5.最後にレッドAセファロースで分画した。6.電気泳動上、単一バンド精製産物を得た。7.ここまで研究をすすめた段階で、CD38ノックアウトマウスを、東北大学岡本教授より頂き、ADPリボシールシクラーゼを測定した。8.膜分画のADPリボシールシクラーゼの95%は消失していた。従って、活性はCD38によっていることが判明した。

研究成果

• [文献書誌] Higashida,H.,Yokoyama,S.,Hashii,M. et al.: "Signal transduction from bradykinin, angiotensin, adrenergic and muscarinic receptors to effector enzymes, including ADP-ribosyl cyclase."Biological Chem.. 382. (2001)
• [文献書誌] Higashida,H.,Hashii,M.,Yokoyama,S. et al.: "Cyclic ADP-ribose as a potential second messenger for neuronal Ca2+ signaling."J.Neurochem.. 76. 321-331 (2000)
• [文献書誌] Higashida,H.,Zhang,J S., et al.: "Angiotensin II cyclic ADP-ribose formation in rat cardiac myocytes."Biochem.J.. 352. 197-202 (2000)
• [文献書誌] Hotta,T.,Asai,K. et al.: "Membrane-bound form of ADP-ribosyl cyclase in rat cortical astrocytes in culture."J.Neurochem.. 74. 669-675 (2000)
• [文献書誌] Hashii,M.,Minabe,Y. et al.: "cADP-ribose potentiates cytosolic Ca2+ elevation and Ca2+ entry via L-type voltage-activated Ca2+ channels in NG 108-15 neuronal cells."Biochem J.. 345. 207-215 (2000)
• [文献書誌] Higashida,H.: "Slow Synaptic Responses and Modulation"Slow synaptic responses in neuronal tumor cells : dual regulation of ADP-ribosyl cyclase and inhibition of M-current by muscarinic receptor stimulation.. 35-41 (1999)