| 研究課題/領域番号 |
12680643
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
機能生物化学
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| 研究機関 | 近畿大学 |
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研究代表者 |
外村 辨一郎 近畿大学, 生物理工学部, 教授 (20026545)
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| 研究分担者 |
滝田 禎亮 京都大学, 大学院・農学研究科, 助手 (70263126)
森本 康一 近畿大学, 生物理工学部, 講師 (10319741)
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| 研究期間 (年度) |
2000 – 2001
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| キーワード | アミノアシルtRNA合成酵素 / リシルtRNA合成酵素 / タンパク質結晶化 / 酵素基質認識機構 / タンパク質蛍光 |
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| 研究概要 |
1.Bacillus stearothermophilusのリシルtRNA合成酵素(B.s.LysRS)の遺伝子及び酵素タンパク質の一次構造:クローン化した遺伝子について塩基配列を決定し、それに基づいてB.s.LvsRS酵素タンパク質の一次構造を推定した。これらについてcodon usageおよびアミノ酸残基の種類の特徴を大腸菌と高度好熱菌のアミノアシルtRNA合成酵素の場合と比較検討し、耐熱性獲得のstrategyを論じた。
2.B.s.LvsRSの結晶化:高度に精製した酵素標品を用い、X線構造解析に供すべく結晶化を行った、分解能2.63Aの回折像を与える結晶を得ることに成功した。大腸菌由来酵素の構造を参照して、分子置換法により分子構造モデルを構築中である。同時に、より高い分解能を求めて、酵素本体および酵素と基質L-リシンの複合体のより良い結晶条件の検索を続行している。
3.B.s.LvsRSの機能解析:本酵素の基質結合部位を形成するアミノ酸残基の中で、基質L-リシンと相互作用し得る位置にある残基を大腸菌酵素の構造との類似性から類推し、それらを部位特異的変異法により置換した変異酵素を作出した。これら酵素につき、L-リシン依存性ATP-PPi交換反応の速度論的バラメターを求めた、また、B.s.LvsRSと基質Lリシンとの結合に際して生ずるタンパク質蛍光変化を指標として、これら人工変異酵素と基質L-リシンとの結合を平衡論的に解析した。これらの結果から、各残基の機能について考察した。
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