研究課題
本申請研究においては、生きた細胞内のRNA分子を特異的に標識する機能性分子プローブを開発することで、複数のRNAの動態を解明する。具体的には、単一の遺伝子から選択的スプライシングによって産生される複数種のmRNAを生きた細胞内において、同時蛍光観察する手法の開発を行うこととした。なお、標的とするmRNAは、細胞骨格に結合するタンパク質である、トロポミオシンとした。基本的なプローブの構造は、RNA結合タンパク質PUM1と蛍光タンパク質の断片を融合したものとした。選択的スプライシングの結果生じるmRNAの特異的な配列をPUM1の結合配列とし、mutant PUMを作製した。このmutant PUMに蛍光タンパク質の断片を融合させた。選択的スプライシングの結果生成する二種類のトロポミオシンmRNAそれぞれに対応するプローブを作製するために、緑色蛍光タンパク質および赤色蛍光タンパク質を用いたことで、二種類のトロポミオシンmRNAを同時に蛍光観察可能となった。生きた細胞内のmRNAの動態を解析した。開発したプローブをマウス繊維芽細胞に導入し、蛍光顕微鏡でプローブの蛍光輝点を観察した。その結果、トロポミオシンmRNAのスプライシング産物が細胞の末端に局在した。本結果は過去の報告と一致しており、開発したmRNAプローブがトロポミオシンの局在を再現可能であることを示している。それぞれのmRNAの動態を画像解析により定量的に評価した結果、定常状態では動態の差異は見られなかった。
2: おおむね順調に進展している
本研究は、RNA検出プローブを新規に開発し、そのRNA検出プローブを用いることで新たな生命現象を解明することを目的とした。申請時の段階において第二年度は、RNA検出プローブの生きた細胞内における性能評価を目標とした。前年度に対象としたトロポミオシンmRNAへの特異性を評価した。今年度は生きた細胞におけるトロポミオシンmRNAの動態を観察した。その結果、既存の報告を再現したことから、開発したRNA検出プローブが生きた細胞内でトロポミオシンmRNAの動態観察に適用可能であることが示せた。
選択的スプライシングと癌化との関係性を解明する。具体的には、開発したmRNA可視化プローブを細胞に導入し、蛍光顕微鏡でmRNAの動態を観察する。そののち、細胞を癌化させ、再び蛍光顕微鏡を用いて選択的スプライシングが変化した結果、mRNAが変化することを観察する。さらに、癌化の前後における対象mRNAの局在や運動形態の変化を追跡することで、選択的スプライシングおよびmRNAの動態が癌化の際に果たす役割を解明する。
すべて 2014 2013
すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件) 学会発表 (6件)
Molecular cell
巻: 53 ページ: 393-406
10.1016/j.molcel.2014.01.009.
