食品蛋白質の遺伝子工学的修飾・分子設計による高機能化

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14360077
• 研究機関: 山口大学
• 研究代表者: 加藤 昭夫 山口大学, 農学部, 教授 (00035114)
• 研究分担者: 内海 成 京都大学, 農学部, 教授 (40111976) ; 阿座上 弘行 山口大学, 農学部, 助手 (40263850)
• キーワード: グリコシル化αラクトアルブミン / マクロファージ / タンパク質の分誌設計 / リゾチーム / フォスビチン

研究概要

遺伝子工学的な手法で食品タンパク質の分子設計を行い、高機能化を目的として研究を進めた。そのために、第一にαラクトアルブミンを酵母Pichia pastoris発現系で分泌し、その機能を検討した。αラクトアルブミンcDNAをPichia pastorisに導入するとグリコシル化αラクトアルブミンが優先的に分泌することが明らかになった。これはαラクトアルブミンは元来N型糖鎖付加シグナル配列(Asn-X-Thr/Ser)を2箇所持っているためで、酵母ではグリコシル化が起こりやすい事を示す。得られたグリコシル化αラクトアルブミンはマクロファージを強く活性化する作用を有するが、グリコシル基を除去するとその活性は低下することが示された。また、αラクトアルブミンにより活性化されたマクロファージは乳癌細胞に対するアポトシスを誘導する可能性が示された。現在、部位指定変異により、糖鎖付加部位を欠損・付加することにより、機能ドメインの同定を検討している。
第二の分誌設計は卵黄フォスビチン由来のフォスフォペプチドをタンパク質のC末端に融合し、酵母発現系でリン酸化タンパク質の作成を行った。リゾチームのC末端に最もリン酸化しやすいペプチド(SSSKSSS)を融合しPichia pastorisで発現させることに成功し、リン酸化の可能性が高いリゾチームを得ることに成功している。このリン酸化リゾチームはグラム陽性菌だけでなく、グラム陰性菌に対しても強い抗菌性を示すことが明らかにされた。

研究成果

• [文献書誌] Y.Song, H.Azakami, S.Begum, J.He, A.Kato: "Different effect of calnexin deletion in Saccharomyces cerevisiae on the secretion of two glycosylated amyloidogenic lysozymes"FEBS Letters. 512. 213-217 (2002)
• [文献書誌] A.Saito, M.Usui, Y.Song, H.Azakami, A.Kato: "Secretion of glycosylated α-lacalbumin in yeast Pichia pastoris"J.Biochem.. 132. 77-82 (2002)
• [文献書誌] S.T.Liu, A.Saito, H.Azakami, A.Kato: "Expression, purification and characterization of an unstable lysozyme mutant in Pichia pastpris"Protein Expression & Purification. 27. 304-312 (2003)
• [文献書誌] Y.Song, A.Saito, M.Usui, H.Azakami: "Relation between the stability of lysozyme mutated at the inside hydrophobic core and secretion in Saccharomyces cerevisiae"Nahrung. 46, No3. 209-213 (2002)
• [文献書誌] Akio Kato: "Handbook of Food Enzymology"Marcel Dekker Inc.. 971-978 (2003)