C型肝炎ウイルス(HCV)複製酵素(NS5B)と製御因子NS5Aの機能解析

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14370054
• 研究機関: 金沢大学
• 研究代表者: 村上 清史 金沢大学, がん研究所, 教授 (90019878)
• 研究分担者: 林 直之 金沢大学, がん研究所, 助手 (50253456)
• キーワード: HCV / NS5B / NS5A / RNAレプリコン / ヌクレオリン / RNA依存RNA合成酵素(RdRP) / 集約型アラニン置換変異ライブラリー

研究概要

HCV慢性肝炎及び関連肝細胞がん発症の予防及び遅延のための創薬の有力な標的は、HCV RNA複製酵素(RdRPと略)である。我々は、アラニン集約型及び点置換型変異NS5Bの解析によりRdRP活性に必須な新たな5アミノ酸残基を特定し、NS5Bのオリゴマー化がRdRP活性に不可欠であることを見い出した。NS5BとNS5Aが直接結合し、NS5B結合にはNS5Aの独立した2つの領域がNS5B結合に必須であった。今年度は、RdRP活性とHCV複製との関連を検討するために、HCV RNAレプリコン系を用いた解析を開始した。
得られた結果は、1)NS5BのRdRP活性に必須な5個のアミノ酸残基の役割を、HCVRNAレプリコン系で評価した。その結果、RdRP活性とin vivo HCV複製とは極めて良く相関した。2)NS5AのNS5B結合に必須な2つの領域の内部欠損及びその領域内に集約型アラニン置換変異を導入したライブラリーを作成し、HCV M1LEレプリコン系を用いて検討した。その結果、領域1(aa94-162)の全ての集約型アラニン置換変異M1LEレプリコンは、HCV複製は観察されなかった。しかし領域2(aa277-334)のN端側のaa277-296をカバーする集約型アラニン置換変異では、in vivo HCV複製が観察された。この結果は、NS5AのNS5B結合性がHCVの複製に必要であることを示唆した。3)ヌクレオリンのNS5B結合によるin vitro RdRP活性への効果を検討した。その結果、NS5Bとの特異的な結合を示す欠損型ヌクレオリンは量依存的にHCV複製を阻害したが、NS5B結合能を欠く欠損型ヌクレオリン蛋白は全く影響を与えなかった。この結果は、ヌクレオリンとNS5Bとの結合がRdRP活性を修飾する可能性を示唆した。

研究成果

• [文献書誌] Hirano, M., et al.: "Direct Interaction between nucleolin and Hepatitis C Virus NS5B"J.Biol.Chem.. 278. 5109-5115 (2003)
• [文献書誌] Wei, W., et al.: "Interaction with general transcription factor IIF(TFIIF) is required for the suppression as activated transcription by RPB5-mediating protein RMP"CellResearch. 13. 111-120 (2003)
• [文献書誌] Masutomi, K., et al.: "Telomerase maintains telomere structure in normal human cells"Cell. 114(2). 241-253 (2003)
• [文献書誌] Kyo, S., et al.: "Significance of immunological detection of human telomerase reverse transcriptase : re-evaluation of expression and localization of human telomerase transcriptase"Am.J.Pathol.. 163(3). 859-867 (2003)
• [文献書誌] Shimakami, T., et al.: "Effect of Interaction between Hepatitis C Virus NS5A and NS5B on the Hepatitis C Virus Replicon"J.Virol.. 78. 2738-2748 (2004)
• [文献書誌] Moon, EJ, et al.: "Hepatitis B Virus X protein induces angiogenesis by stabilizing hypoxia-inducible factor-1alpha"FASEB J.. 18(2). 382-384 (2004)