| 研究分担者 |
森重 健一郎 大阪大学, 医学系研究科, 助手 (90283788)
大道 正英 山形大学, 医学部, 講師 (10283764)
坂田 正博 大阪大学, 医学系研究科, 講師 (10260639)
武田 卓 大阪大学, 医学系研究科, 助手 (20301260)
田原 正浩 大阪大学, 医学系研究科, 助手 (00294091)
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| 研究概要 |
FRET(fluorescence energy transfer)を用いたエキソサイトーシス時のリガンド,受容体の細胞内移動動態の解析には,まずFRETを用いたシステムを立ち上げることが必須である。そこでまず,扱いにくい受容体などの膜タンパク質でなく,いままでの実績のある(Mochizuki, Nature,411,1065,2001),細胞内のメッセンジャー蛋白質であるRas, Rhoとそれぞれのエフェクター蛋白のRaf, PKNとの間のFRET現象の観察を,今回のプロジェクトの前段階として行うこととした。
細胞はわれわれの実験室で今まで多用してきた卵巣癌細胞株Caov3を用い,RasにYFP, RafにCFPが付いた蛋白を合成出来るプラスミドを作成した。
次いで両者をCaov3に一時的強制発現させることに成功した。FRET現象を観察するには,2分子がそれぞれ均等に発現していなければ,安定したデータを得ることが出来ない。現在この発現系において,両者がコンスタントに発現できるような条件を検討中である。
同時に両蛋白を等量ずつ発現させるため,二つのプラスミドをhingeで繋いで一つのプラスミドとし,均等な発現できるようなシステムを構築中である。
またRhoにCFP, PKNにYFPを付けたプラスミドも作成し,同様の検討を行っている。
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