研究課題
本研究の目的は、高輝度のフェムト秒赤外レーザーを光源に用いて、いまだ困難とされるフロー型の時間分解赤外分光装置を開発し、酵素反応の観測に応用することである。装置の第一の応用として、一酸化窒素還元酵素（NOR）の酵素反応を追跡し、反応機構を解明する。昨年度は、脱窒菌由来NOR（cNOR）のキーとなる反応過渡種（NO活性型）の検出を目指して、プロトン輸送経路上のアミノ酸残基を置換した変異体 E57A を調製した。NO活性型はプロトン化により分解するので、変異導入によりプロトン化を律速段階にすることで、NO活性型の安定化を図った。E57Aの酵素活性はWTの10%程度であった。本年度はまず、E57Aの反応速度論解析を行なった。その結果、WTの酵素反応は3相性（数マイクロ秒、100マイクロ秒、数ミリ秒）を示す一方、E57Aではミリ秒の第3相が観測されず、反応は第2相で停止することが分かった。このことは第3相の過程にプロトン移動が関与していることを示している。現在、第2相で生成するプロトン移動直前の反応過渡種を時間分解赤外分光で詳細に解析しているところである。また、cNOR以外にも脱窒カビ由来NOR（P450nor）の酵素反応を、時間分解赤外分光で観測し、NOが活性化した反応中間体の化学種を決定した（Fe(III)-NHO-）。また、SACLAを用いた時間分解X線結晶構造解析を行ない、反応中間体のNO配位構造の決定にも成功した。P450norの反応機構の全容解明に成功した。
29年度が最終年度であるため、記入しない。
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すべて 雑誌論文 (4件) (うち査読あり 4件、 オープンアクセス 3件) 学会発表 (10件) (うち国際学会 2件、 招待講演 4件)
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