マイクロ流体フロー時分割赤外分光光度計の開発と酵素反応の短寿命中間体の解析

• 研究課題/領域番号: 15H03841
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 生体関連化学
• 研究機関: 国立研究開発法人理化学研究所
• 研究代表者: 久保 稔 国立研究開発法人理化学研究所, 放射光科学総合研究センター, 専任研究員 (90392878)
• 連携研究者: 當舎 武彦 国立研究開発法人理化学研究所, 放射光科学総合研究センター, 専任研究員 (00548993) ; 木村 哲就 神戸大学, 大学院理学研究科, 特命講師 (70506906)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2017年度)
• 配分額: 17,810千円 (直接経費: 13,700千円、間接経費: 4,110千円); 2017年度: 2,080千円 (直接経費: 1,600千円、間接経費: 480千円); 2016年度: 2,470千円 (直接経費: 1,900千円、間接経費: 570千円); 2015年度: 13,260千円 (直接経費: 10,200千円、間接経費: 3,060千円)
• キーワード: 時間分解赤外分光 / マイクロ流路フローセル / 酵素反応 / 膜タンパク質 / 一酸化窒素還元酵素 / 超精密計測 / フェムト秒レーザー / ケージド化合物 / ポンププローブ法 / 蛋白質 / 高性能レーザー / 生物物理

研究成果の概要

本研究では、これまで困難であった酵素反応の動的構造解析を実現する時分割赤外分光技術を確立した。20 nL単位で送液できる精密フローシステムを開発し、過去に開発したフェムト秒赤外レーザーベースの高感度赤外分光装置に組み込むことで、ケージド基質を用いた酵素反応のマイクロフロー・フラッシュ測定を可能にした。次に応用研究として、地球上の窒素循環を担う一酸化窒素還元酵素の酵素反応を時分割解析し、短寿命のNO結合型中間体の配位様式の解明に成功した。さらに、マイクロフロー・フラッシュ測定法をSACLAでの時分割結晶構造解析にも応用することで、NO結合型中間体の構造の可視化にも成功した。

研究成果

• [雑誌論文] Ultraprecision cutting of single-crystal calcium fluoride for fabricating micro flow cells (2018)
  • 著者名/発表者名: Ryo KOMIYA, Tetsunari KIMURA, Takashi NOMURA, Minoru KUBO, Jiwang YAN
  • 雑誌名: Journal of Advanced Mechanical Design, Systems, and Manufacturing 巻: 12 号: 1 ページ: JAMDSM0021-JAMDSM0021
  • DOI: 10.1299/jamdsm.2018jamdsm0021
  • NAID: 130006386864
  • ISSN: 1881-3054
  • 査読あり
• [雑誌論文] Capturing an initial intermediate during the P450nor enzymatic reaction using time-resolved XFEL crystallography and caged-substrate (2017)
  • 著者名/発表者名: Tosha Takehiko、Kubo Minoru, et. al
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 8 号: 1 ページ: 1-9
  • DOI: 10.1038/s41467-017-01702-1
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Nanosecond pump probe device for time-resolved serial femtosecond crystallography developed at SACLA (2017)
  • 著者名/発表者名: Kubo Minoru、Nango Eriko、Murata Michio、Neutze Richard、Yabashi Makina、Iwata So, その他１８名
  • 雑誌名: Journal of Synchrotron Radiation 巻: 24 号: 5 ページ: 1086-1091
  • DOI: 10.1107/s160057751701030x
  • NAID: 120006363292
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] A nanosecond time-resolved XFEL analysis of structural changes associated with CO release from cytochrome c oxidase. (2017)
  • 著者名/発表者名: Shimada, A.†, Kubo, M.†, Baba, S.† et al. (29人中2番目)(†equal contribution)
  • 雑誌名: Sci. Adv. 巻: 3 号: 7
  • DOI: 10.1126/sciadv.1603042
  • NAID: 120006363290
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Light-induced structural changes and the site of O=O bond formation in PSII caught by XFEL. (2017)
  • 著者名/発表者名: Suga, M.†, Akita, F.†, Sugahara, M.†, Kubo, M.†, Nakajima, Y.† et al. (†equal contribution)(38人中1番目)
  • 雑誌名: Nature 巻: 543 号: 7643 ページ: 131-135
  • DOI: 10.1038/nature21400
  • NAID: 120006344935
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Lipidic cubic phase injector is a viable crystal delivery system for time-resolved serial crystallography. (2016)
  • 著者名/発表者名: Nogly, P., et al. (40人中8番目)
  • 雑誌名: Nat. Commun. 巻: 7 号: 1 ページ: 12314-12314
  • DOI: 10.1038/ncomms12314
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] A three dimensional movie of structural changes in bacteriorhodopsin. (2016)
  • 著者名/発表者名: Nango, E., Royant, A.†, Kubo, M.† et al. (†equal contribution)(45名中2番目)
  • 雑誌名: Science 巻: 354 号: 6319 ページ: 1552-1557
  • DOI: 10.1126/science.aah3497
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] A Study of the Dynamics of the Heme Pocket and C-helix in CooA Upon CO Dissociation Using Time-resolved Visible and UV Resonance Raman Spectroscopy (2016)
  • 著者名/発表者名: Akihiro Otomo, Haruto Ishikawa, Misao Mizuno, Tetsunari Kimura, Minoru Kubo, Yoshitsugu Shiro, Shigetoshi Aono, and Yasuhisa Mizutani
  • 雑誌名: J. Phys. Chem. B 巻: 120 号: 32 ページ: 7836-7843
  • DOI: 10.1021/acs.jpcb.6b05634
  • 査読あり
• [雑誌論文] Molecular mechanism of the catalytic reaction of NO reductase revealed by novel time-resolved visible/IR absorption spectrometers with microfluidic device (2016)
  • 著者名/発表者名: Kimura, T., Takeda, H., Ishii, S., Tosha, T., Shiro, Y., Kubo, M.
  • 雑誌名: Biophysical Journal 巻: 110 Supp1 号: 3 ページ: 548a-548a
  • DOI: 10.1016/j.bpj.2015.11.2933
• [学会発表] Observation of water-channel opening of cytochrome c oxidase by time-resolved XFEL crystallography. (2017)
  • 著者名/発表者名: Kubo, M., Shimada, A., Baba, S., Yamashita, K., Hirata, K., Yamamoto, M., Shinzawa-Itoh, K., Ago, H., Yoshikawa, S., Tsukihara, T.
  • 学会等名: 19th International Union for Pure and Applied Biophysics Congress and 11th European Biophysics Congress
  • 国際学会
• [学会発表] Time-resolved XFEL crystallography and spectroscopy of cytochrome c oxidase. (2017)
  • 著者名/発表者名: Kubo, M., Shimada, A., Baba, S., Yamashita, K., Hirata, K., Yamamoto, M., Shinzawa-Itoh, K., Ago, H., Yoshikawa, S., Tsukihara, T.
  • 学会等名: 24th Congress & General Assembly of the International Union of Crystallography (IUCr 2017)
  • 国際学会
• [学会発表] 蛋白質の時間分解X線結晶構造解析における分光の役割． (2017)
  • 著者名/発表者名: 久保稔
  • 学会等名: 第17回日本蛋白質科学会年会，ワークショップ “SACLAにおける蛋白質構造科学研究の現状と展望”
  • 招待講演
• [学会発表] Combining XFEL crystallography and single-crystal spectroscopy for studying reaction dynamics of respiratory metalloenzymes． (2017)
  • 著者名/発表者名: 久保稔
  • 学会等名: 日本生物物理学会，第55回年会シンポジウム “構造生命科学の新しい潮流”
  • 招待講演
• [学会発表] XFEL結晶構造解析と赤外分光法を用いたタンパク質の動的精密構造解析． (2017)
  • 著者名/発表者名: 久保稔
  • 学会等名: 2017年度第1回水和ナノ構造研究会
  • 招待講演
• [学会発表] チトクロム酸化酵素の動的構造解析：リガンド結合と共役した水チャネルの開閉機構． (2017)
  • 著者名/発表者名: 久保稔
  • 学会等名: 2017年度生命科学系学会合同年次大会（ConBio2017），ワークショップ “X線自由電子レーザーが捉えるタンパク質ダイナミクス研究の最前線”
  • 招待講演
• [学会発表] 凍結トラップX線結晶構造解析および時間分解赤外分光法を用いた P450nor の反応中間体の構造解析． (2017)
  • 著者名/発表者名: 野村高志, 當舎武彦, 杉本宏, 久野玉雄, 山際来佳, Chai Gopalasingam, 山下恵太郎, 平田邦生, 山本雅貴, 城宣嗣, 久保稔
  • 学会等名: 平成29年度日本結晶学会年会
• [学会発表] 時間分解赤外分光法および凍結トラップXFEL結晶構造解析を用いたP450norの反応中間体の解析． (2017)
  • 著者名/発表者名: 野村高志, 當舎武彦, 杉本宏, 久野玉雄, 山際来佳, Chai Gopalasingam, 山下恵太郎, 平田邦生, 山本雅貴, 城宣嗣, 久保稔
  • 学会等名: 第44回生体分子科学討論会
• [学会発表] X線自由電子レーザーを利用した時間分解X線結晶構造解析による酵素反応の観測． (2017)
  • 著者名/発表者名: 當舎武彦, 西田拓真, 野村高志, 佐伯直哉, 杉本宏, 山下恵太郎, 平田邦生, 吾郷日出夫, 山本雅貴, 中根崇智, 菅原道泰, 南後恵理子, 岩田想, 城宜嗣, 久保稔
  • 学会等名: 第44回生体分子科学討論会
• [学会発表] Elucidation of the NO reduction mechanism of nitric oxide reductase using time-resolved vis/IR spectroscopy． (2017)
  • 著者名/発表者名: 武田英恵，木村哲就，野村高志，松林亜希子，石井頌子，當舎武彦，城宜嗣，久保稔
  • 学会等名: 日本生物物理学会，第55回年会
• [学会発表] Time-resolved crystallography and IR spectroscopy of cytochrome c oxidase. (2017)
  • 著者名/発表者名: Kubo, M.
  • 学会等名: The 4th Ringberg Workshop on Structural Biology with FELs
  • 発表場所: Ringberg Castle (83708 Kreuth, Germany)
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Molecular mechanism of the catalytic reaction of NO reductase revealed by novel time-resolved visible/IR absorption spectrometers with microfluidic device (2016)
  • 著者名/発表者名: Kimura, T., Takeda, H., Ishii, S., Tosha, T., Shiro, Y., Kubo, M.
  • 学会等名: The 60th Biophysical Society Annual Meeting
  • 発表場所: Los Angeles Convention Center (Los Angeles, USA)
  • 年月日: 2016-03-02
  • 国際学会
• [学会発表] ダイナミクス研究における未解決問題と振動分光からのアプローチ (2016)
  • 著者名/発表者名: 久保稔
  • 学会等名: 蛋白研セミナー “構造を基盤とする蛋白質科学における未解決問題”
  • 発表場所: 東京大学先端科学技術研究センター（東京都目黒区）
  • 年月日: 2016-03-01
  • 招待講演
• [学会発表] フェムト秒赤外レーザーを用いた生体分子ダイナミクスの観測 (2016)
  • 著者名/発表者名: 久保稔，木村哲就，武田英恵，石井頌子，當舎武彦，城宜嗣
  • 学会等名: 分子研研究会“高輝度・高強度赤外光源の現状と展望”
  • 発表場所: 岡崎コンファレンスセンター（愛知県岡崎市）
  • 年月日: 2016-02-11
• [学会発表] SACLAが拓く応用研究：生体分子の動的構造観察． (2016)
  • 著者名/発表者名: 久保稔
  • 学会等名: 日本分光学会関西支部，平成28年度 最近の分光学の進歩に関する講演会 “自由電子レーザーの進歩と実用”
  • 発表場所: 大阪電気通信大学 駅前キャンパス（寝屋川市早子町）
  • 招待講演
• [学会発表] Observation of water channel opening upon CO photolysis in cytochrome c oxidase by time-resolved XFEL crystallography and IR spectroscopy. (2016)
  • 著者名/発表者名: Kubo, M., Shimada, A., Baba, S., Yamashita, K., Hirata, K., Yamamoto, M., Shinzawa-Itoh, K., Tsukihara, T., Ago, H., Yoshikawa, S.
  • 学会等名: The 42nd Naito Conference "In the Vanguard of Structural Biology: Revolutionizing Life Sciences"(ポスター賞受賞)
  • 発表場所: シャトレーゼガトーキングダム（札幌市北区）
  • 国際学会
• [学会発表] 膜タンパク質の反応解析に向けた赤外分光技術の開発と膜内在性金属酵素への応用． (2016)
  • 著者名/発表者名: 久保稔
  • 学会等名: 蛋白研セミナー “膜タンパク質の構造ダイナミクス”
  • 発表場所: 大阪大学吹田キャンパス 蛋白質研究所（吹田市山田丘）
  • 招待講演
• [学会発表] Kinetic analysis of the NO reduction reaction of nitric oxide reductase using nanoliter-flow time-resolved visible/IR spectroscopy. (2016)
  • 著者名/発表者名: Takeda, H., Kimura, T., Ishii, S., Tosha, T., Shiro, Y., Kubo, M.
  • 学会等名: The 4th International Symposium for Young Chemists on Stimuli-Responsive Chemical Species for the Creation of Functional Molecules.
  • 発表場所: 大阪大学吹田キャンパス サントリーメモリアルホール（吹田市山田丘）
  • 国際学会
• [学会発表] マイクロ流路フロー・フラッシュ時間分解赤外分光法による一酸化窒素還元酵素の反応機構解析． (2016)
  • 著者名/発表者名: 木村哲就, 武田英恵, 石井頌子, 當舎武彦, 城宜嗣, 久保稔
  • 学会等名: 第43回生体分子科学討論会
  • 発表場所: 名古屋大学野依記念学術交流館（名古屋市千種区）
• [学会発表] Development of a highly-sensitive time-resolved IR spectrometer and its application to high-background aqueous biological samples (2015)
  • 著者名/発表者名: Kubo, M., Kimura, T., Yamaguchi, Y., Yanagisawa, S., Komiya, R., Yan, J., Nakashima, S., Ogura, T., Shiro, Y.
  • 学会等名: Pacifichem 2015
  • 発表場所: Marriott Waikiki Beach (Hawaii, USA)
  • 年月日: 2015-12-18
  • 国際学会
• [学会発表] Development of a time-resolved visible/IR absorption spectrometer with a novel microfluidic device and its application to catalytic reaction of NO reductase (2015)
  • 著者名/発表者名: Kimura, T., Ishii, S., Tosha, T., Shiro, Y., Kubo, M.
  • 学会等名: Pacifichem 2015
  • 発表場所: Hawaii Convention Center (Hawaii, USA)
  • 年月日: 2015-12-16
  • 国際学会
• [学会発表] マイクロ流体フロー・フラッシュ赤外分光測定系による一酸化窒素還元酵素の触媒反応の実時間観察 (2015)
  • 著者名/発表者名: 木村哲就, 石井頌子, 當舎武彦, 城宜嗣, 久保稔
  • 学会等名: 第9回分子科学討論会
  • 発表場所: 東京工業大学大岡山キャンパス（東京都目黒区）
  • 年月日: 2015-09-19
• [学会発表] Development of micro-channel flow-flash infrared absorption spectroscopy and its application to early intermediate of nitric oxide reductase (2015)
  • 著者名/発表者名: 木村哲就，石井頌子，當舎武彦，城宜嗣，久保稔
  • 学会等名: 日本生物物理学会，第53回年会
  • 発表場所: 金沢大学角間キャンパス（石川県金沢市）
  • 年月日: 2015-09-14
• [学会発表] マイクロ流体フローを用いた一酸化窒素還元酵素の触媒反応の動的分光観察 (2015)
  • 著者名/発表者名: 木村哲就, 石井頌子, 當舎武彦, 城宜嗣, 久保稔
  • 学会等名: 第15回日本蛋白質科学会年会 若手奨励賞シンポジウム
  • 発表場所: あわぎんホール（徳島県徳島市）
  • 年月日: 2015-06-25
  • 招待講演