| 研究課題/領域番号 |
15H04611
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
山本 幸治 九州大学, 農学研究院, 助教 (00346834)
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| 研究分担者 |
坪田 拓也 国立研究開発法人農業生物資源研究所, その他部局等, 主任研究員 (00612772)
有竹 浩介 筑波大学, 国際統合睡眠医科学研究機構, 准教授 (70390804)
東浦 彰史 大阪大学, たんぱく質研究所, 助教 (90598129)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | プロスタグランジン |
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| 研究実績の概要 |
平成28年度は、（１）昆虫由来プロスタグランジンD合成酵素（PGDS）の活性触媒部位アミノ酸の同定、（２）ノックインカイコの作製、（３）質量分析装置を用いたノックインカイコ個体中のプロスタグランジンの測定、について試みた。（１）について、すでに同定済みであるPGDS分子中のアミノ酸残基を部位特異的アミノ酸置換法によりAlaへ変異した。各酵素変異体の組換え酵素を大腸菌にて発現し、精製した。平成27年度に完成したアッセイ法により、それぞれの変異が活性に及ぼす影響について調査した。その結果、これらの残基はグルタチオンが結合した際に生じるプロトンリレーに携わっていることが示された。PGDSと基質・プロスタグランジンH（PGH）との複合体結晶は未だ得られていない。そこで、共結晶そしてソーキング法を用いて複合体結晶作成を試みた。複合体結晶は平成28年度中に得ることはできなかったが、他分子種との重ね合わせにより、4個の残基を基質結合に関与するアミノ酸として見出した。（２）に関して、まずプロスタグランジンE合成酵素（PGES）遺伝子をゲノム編集技術TALENを用いたノックインの標的とした。その結果、PGES遺伝子ノックインカイコの作製に成功した。作出されたノックインカイコを受け入れて、飼育ならびに観察を行なった。（３）の実験については、ノックインカイコ個体中のプロスタグランジンは質量分析装置により検出されなかった。この結果は、PGESのノックインによるものと推察された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成28年度においては、PGESノックインカイコの作製に成功した。これにより、カイコ各組織の形態そして組織成熟関連遺伝子の発現を野生型カイコと比較することが可能となった。
PGESの基質結合部位を立体構造的に解析し、基質結合に重要なアミノ酸残基を同定した。得られた結果と酵素化学的速度論的解析結果と合わせて、特異的阻害剤の探索を進めていく。
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| 今後の研究の推進方策 |
昨年度の結果を踏まえて、PGES分子中の基質結合アミノ酸残基を部位特異的アミノ酸置換法により、それぞれのアミノ酸残基へ変異導入する。各アミノ酸変異のPGES活性に及ぼす影響を調査する。合わせて、変異型と野生型個体間の組織成熟関連遺伝子の発現解析、組織形態観察そしてプロスタグランジン含有量比較を行い、論文作成する予定である。
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