| 研究課題/領域番号 |
15K06818
|
|---|
| 研究機関 | 公益財団法人東京都医学総合研究所 |
|---|
研究代表者 |
松岡 邦枝 公益財団法人東京都医学総合研究所, ゲノム医科学研究分野, 主席研究員 (40291158)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
|
| キーワード | 難聴 / 疾患モデルマウス / 内耳外有毛細胞 / CRISPR/Cas9システム |
|---|
| 研究実績の概要 |
本研究は、聞こえの調節に極めて重要な役割を担う内耳外有毛細胞（OHC）特異的に発現する遺伝子の機能解析を行うことにより、OHCの形成機構および聴覚機能のメカニズムを解明することを目的としている。本年度は、我々が開発したOHCを任意の時期に破壊可能なOHC-TRECKマウスを用いてマイクロアレイ解析を行い、昨年度行ったRNA-seq解析の結果を検証した。内耳蝸牛における発現遺伝子を網羅的に比較することにより、OHC破壊マウスの蝸牛において著しく発現量が減少する遺伝子として新規にPpp1r17を同定し、CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集を行い、12系統の変異マウスを作出した。それらの中からPpp1r17の機能を欠損する系統を選抜し、表現型解析に向けて繁殖中である。
また、既に作製に成功しているOHC特異的発現遺伝子Oncomodulin（Ocm）のノックアウト（KO）マウスについて詳細な表現型解析を行った。免疫組織学的解析の結果、Ocm-KOマウスの内耳コルチ器においてOHCは正常マウスと同様に3列に整列し、OHCの機能に重要な伸縮運動に寄与するプレスチンの発現も正常であった。ラセン神経節・ラセン靱帯および血管条においても組織学的異常は認められなかった。オープンフィールドテストを行った結果、Ocm-KOマウスの平衡機能に関連した調査項目は、すべて正常であった。しかしながら、4～32 kHzの音刺激に対する聴力をABR法により経時的に測定した結果、Ocmの欠失によって高周波から加齢性に聴覚障害が引き起こされることが明らかとなった。さらに、免疫組織化学的解析の結果、OHCにおけるシナプスの形成異常が認められ、加齢に伴いOHCの数が減少していた。また、走査型電子顕微鏡（SEM）解析により聴毛の短縮が認められることが判明した。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
前年度までに行ったRNA-seq解析の結果を検証するため、内耳蝸牛に限定してRNAを調整しマイクロアレイ解析を行った結果、OHC破壊マウスではイオントランスポーター・アミノ酸トランスポーターおよびGABA作動性ニューロン関連遺伝子の顕著な発現減少を確認した。特に著しく発現が減少する遺伝子としてPpp1r17を同定し、当初の計画通り、当該遺伝子の聴覚における機能を解明するため新たにPpp1r17のKOマウスの樹立に成功し、既に繁殖態勢に入っている。
また、前年度までに作出していたOcm-KOマウスの表現型解析は順調に進展し、高周波から加齢性の聴覚障害を呈すること、OHC上端に存在する聴毛の短毛化、OHCの下部に存在するシナプス構造の異常、加齢に伴うOHCの減少等を見出し、Ocmが聴覚機能の維持に重要な役割を担っていることを明らかにした。
|
| 今後の研究の推進方策 |
Ppp1r17-KOマウスについて、詳細な表現型解析を行う。まず、ABR法により4～32 kHzのトーンピップ音に対する聴力を測定し、Ppp1r17-KOマウスの聴力変化を経時的に調べる。また、歪成分耳音響放射（DPOAE）検査を実施し、OHCに特有な伸縮運動を評価する。OHCのホールマウント標本の免疫組織化学的解析により、Ppp1r17の欠損が内耳の形態に与える影響を調査する。すなわち、OHCマーカーであるプレスチン、有毛細胞マーカーMYO6、支持細胞マーカーSOX2、細胞間タイトジャンクションに発現するZO-1、神経細胞マーカーβ3チューブリン、シナプスマーカーSYPを認識する特異抗体やF-アクチンと特異的に結合するファロイジンを用いて組織染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡で観察し、コルチ器のイメージングを行う。また、走査型電子顕微鏡（SEM）および透過型電子顕微鏡（TEM）による解析を行い、OHCにおける聴毛の形態およびOHCの内部構造を明らかにする。
一方、Ocm-KOマウスの表現型解析も継続して行う。本年度の解析結果より、成体マウスのOHCにおけるシナプスの構造に異常が認められたので、形成過程に異常があるのか、形成後に構造を維持できないのかを明らかにするため、内耳の成熟過程におけるシナプス構造をSYPの発現を指標として解析し、さらにTEMによる微細構造を調べる。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度は、CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集により新規にKOマウスの樹立を目指し、複数回のマイクロインジェクションが必要であると考えていたが、1回のインジェクションで目的のマウスを得ることができた。また、Ocm-KOマウスの聴力測定、免疫組織化学的解析、マイクロアレイ解析のために多数のマウス個体が必要であるため、体外受精による繁殖を計画していたが、繁殖率が良好であり、自然繁殖により必要な個体数が得られた。以上の理由により、本年度の申請額と使用額に差違が生じた。
|
| 次年度使用額の使用計画 |
平成28年度は、Ppp1r17-KOマウスおよびOcm-KOマウスについて、今後の推進方策に記載した表現型解析を行う。これまでの研究成果に鑑み、マーカー遺伝子の発現を調べる目的で、免疫組織化学的解析のために数種類の高価な抗体を購入する必要が生じたので、これに使用する
|
