| 研究課題/領域番号 |
15K06900
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| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
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研究代表者 |
三好 浩之 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 特任准教授 (70219830)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 細胞老化 / リプログラミング |
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| 研究実績の概要 |
細胞老化は、DNA損傷、酸化ストレス、がん遺伝子発現などのストレスによって誘導され、不可逆的に細胞分裂が停止する現象であるが、その分子機構はまだ不明な点が多い。本研究では、分裂停止した老化細胞からiPS細胞を樹立し、老化前の細胞由来iPS細胞や元の老化細胞との間で、遺伝子発現レベル、エピジェネティックな変化、細胞周期や細胞機能などの性状を比較解析することにより、細胞老化の分子メカニズム解明の新たな糸口を見いだすことを目的としている。
これまでに、分裂能を完全に失い老化した正常ヒト線維芽細胞から、リプログラミング因子(OCT3/4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28)に加えSV40LTを一過性に発現させ、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤とヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤を添加することにより、極めて低い頻度ではあるがiPS細胞を樹立することができた。老化細胞由来iPS細胞の増殖や形態は、50回以上継代を重ねても、老化前の細胞由来iPS細胞と変わらず、網羅的遺伝子発現、DNAメチル化、ヒストン修飾の比較解析においても差はほとんど見られなかった。また、iPS細胞から線維芽細胞へ分化誘導し、継代培養後の細胞老化についても差は見られなかった。これらのことから、エピジェネティックな変化によって細胞は老化するが、リプログラミングによって分裂停止した老化細胞は若返ることができると考えられる。しかしながら、iPS細胞の樹立効率が極めて低かったことから、樹立できたiPS細胞はまだ完全に老化して分裂停止していなかった細胞に由来する可能性が否定できない。そこで、老化線維芽細胞とiPS細胞との細胞融合を行い、4倍体のiPS細胞の樹立を試みることにより、老化細胞のリプログラミング効率について検証している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
分裂能を完全に失い老化した正常ヒト線維芽細胞(NB1RGB, TIG1)に、染色体に組み込まれないレンチウイルスベクターによってSV40LTを一過性に発現させ、さらにリプログラミング因子をレンチウイルスベクターによって導入し、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤(RG108)とヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤(BIX01294)を添加することにより、非常に低い頻度(0.0000026～0.00001%)ではあるがiPS細胞を樹立することができた。iPS細胞の樹立は、未分化マーカー(SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81)の発現を免疫染色法により確認し、多能性の確認は免疫不全マウスへの移植によるテラトーマ形成により行った。老化細胞由来iPS細胞の増殖や形態は、50回以上継代を重ねても、老化前の細胞由来iPS細胞と変わらない。マイクロアレイとRNA-Seqによる網羅的遺伝子発現解析、27,578ヶ所のCpGサイトのDNAメチル化解析、H3K4me3、H3K9me3、H3K27me3抗体のChIP-Seqによるゲノムワイドのヒストン修飾解析でも、両者で差はほとんど見られなかった。また、iPS細胞から線維芽細胞へ分化誘導した後の分裂寿命についても差は見られなかった。しかしながら、樹立できたiPS細胞はまだ完全に老化して分裂停止していなかった細胞に由来する可能性が否定できない。そこで、老化線維芽細胞とiPS細胞との細胞融合を行い、4倍体のiPS細胞の樹立を試みることにより、老化細胞のリプログラミング効率について検証している。平成29年度は、センダイウイルス(HVJ)を使用した細胞融合法を用いて、まず老化前の線維芽細胞(Bsd)とiPS細胞(Puro)との細胞融合を行なったが、いろいろ条件検討を行ったものの4倍体のiPS細胞は樹立できなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成30年度は、細胞融合の方法としてポリエチレングリコール(PEG)法および電気的融合法を検討する。
また一方、平成29年度に、分裂停止した老化線維芽細胞と老化前の線維芽細胞について、ヒストン修飾状態およびDNAメチル化状態と遺伝子発現の関係をゲノムワイドに比較解析したところ、細胞老化に関わると考えられるいくつかの遺伝子発現の変化を見出した。そこで、平成30年度は、細胞老化への関与が示唆された遺伝子について、老化細胞および老化前の細胞にこれらの遺伝子の導入やノックダウンなどを行い、細胞老化への関与についての解析を進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
計画していた細胞融合の実験が、技術的な問題により進まなかったため。また、研究成果を学会で発表するため旅費を計上したが、発表に至らなかったため旅費を使用しなかったため。平成30年度は、おもに細胞融合実験のための消耗品費、研究成果を学会で発表するための旅費と論文投稿のために研究費を使用する予定である。
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