| 研究課題/領域番号 |
15K08194
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| 研究機関 | 長浜バイオ大学 |
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研究代表者 |
永井 信夫 長浜バイオ大学, バイオサイエンス学部, 教授 (90260281)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 脳梗塞 / 線溶系 / 血管透過性 / マトリックスメタロプロテイナーゼ / プラスミノゲン / ｔPA / uPA |
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| 研究実績の概要 |
脳梗塞後４日目の血管透過性領域において、プラスミン活性化に伴い組織修復に寄与するマトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）が寄与する可能性を検討した。その結果、野生型マウスでは、血管透過性亢進領域とさらにその外縁部領域でMMP活性の上昇を認めた。一方、線溶因子であるプラスミノゲンの遺伝子欠損マウスでは、血管透過性領域でのMMP活性の上昇が認められなかったものの、外縁部領域での活性は認められた。この結果より、血管透過性亢進に関連してMMP活性の上昇が誘導されること、さらにその上昇は透過性亢進領域ではプラスミンによる活性が起こるものの、その外縁部ではプラスミン非依存的なMMP活性亢進が誘導されることが明らかとなった。
血管透過性亢進に伴うプラスミン活性化のメカニズム解明する目的で、プラスミノゲンアクチベーターであるtPA及びuPAの寄与を検討した。その結果、脳梗塞後４日目の傷害周囲の血管透過性亢進領域でのプラスミンの亢進はtPA遺伝子欠損マウスでも認められた。一方、uPA遺伝子欠損マウスでは活性の減弱が認められた。この結果より、血管透過性亢進に伴うプラスミン活性化はuPAにより誘導されることが示唆された。
マウス脳由来血管内皮細胞株のbEnd.3の単層培養系における２槽培養系細胞膜抵抗による血管透過性の評価条件を検討した。培養開始時の播種細胞数、培養期間、および培養皿のコラーゲンコートの影響を検討した。その結果、1.0ｘ10の6乗/wellで10日以上培養した場合、高い抵抗値が得られることを明らかにした。また、コラーゲンコートは抵抗値の上昇を誘導した。これらの結果より、実験条件を決定した。
また、マウス脳由来の血管内皮細胞の初代培養の確立を試みた。現在、細胞を得る個体の週齢、細胞処理の条件、培養皿のコーティングの条件を検討し、約90％の純度の細胞の培養条件を確立した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
免疫組織化学による血管透過性に関与する因子（occludin, claudin-5, alpha2beta1-integrin、VE-Cadherin）の発現の評価については、プラスミン活性化のメカニズムの検討を先行させたため、遅れている。特に、occludinについては免疫染色の条件の検討中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
27年度の検討より、MMP活性にプラスミン依存性と非依存のメカニズムが存在することが示唆された。この結果は、血管透過性亢進領域で複数のMMPが関与する可能性を強く示唆している。このため、血管透過性亢進領域で発現するMMPの分子種とその分布をそれぞれqPCR法と免疫組織化学法により検討する実験を追加する。
脳梗塞後の血管透過性亢進とその修復に関わる因子の発現プロファイルの検討を行う。傷害1，4，7日後の脳梗塞領域でのoccludin, claudin-5, alpha2beta1-integrin、VE-Cadherinの発現をqPCRにより検討する。さらに、その分布を免疫組織化学法により検討する。
培養細胞系の実験に於いては、マウス脳血管細胞株であるbEnd.3による検討に加え、初代培養細胞を使用する新規の実験を追加する。
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