| 研究課題/領域番号 |
15K08660
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| 研究機関 | 姫路獨協大学 |
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研究代表者 |
西郷 勝康 姫路獨協大学, 薬学部, 教授 (20304107)
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| 研究分担者 |
炬口 真理子 姫路獨協大学, 薬学部, 准教授 (10379430)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 好中球 / 細胞外トラップ / フローサイトメトリー / ヘミン |
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| 研究実績の概要 |
好中球細胞外トラップ（NETs）現象の観察法につき検討している。NET形成は種々の重症病態における臓器障害と関連していることが示されており、簡便計測法の確立は重症病態診断の一助になるものと期待される。
（１）簡便計測法として期待しているのは、フローサイトメトリーを用いたNET形成細胞の検出法であるが、細胞処理に用いる界面活性剤や浸透圧の影響について検討した。その結果、特定の浸透圧条件では、フォルボールエステル誘導性NET形成細胞が、特定の細胞集団を形成することが判明し、定量化が可能であると考えられる。さらに、種々の刺激で形成されたNETの比較検討が必要と思われる。確立されたNET観察法である、蛍光顕微鏡による観察、免疫染色法による観察と並行して臨床的有用性について検討していきたい。さらに汎用フローサイトメトリのみならず、自動血球計数器での観察、すなはちNET形成細胞の自動計測、が可能となるよう、条件設定を試みたい。
（２）In vitro検討に用いることができるNET定量法として、Sytox Greenを用いた定量法（プレート法）を確立し、これまでの研究の継続であるヘミンによるNET形成に関わる機序の解明などに向け検討を継続中である。NET形成にかかわる活性酸素種産生にかかわるミトコンドリアの関与や、刺激伝達メカニズムが、フォルボールエステルで誘導される場合と異なる可能性が示唆されている。
（３）トロンボモジュリン製剤は、播種性血管内凝固症候群(DIC)の新しい治療薬として期待されている。種々の炎症を抑制する効果が、これまでの抗DIC薬との大きな相違と考えれる。われわれは、本剤が好中球機能にも影響するのではないかと考え、NET形成を含む種々の好中球機能に及ぼす影響を検討したが、活性酸素種産生やNET形成には影響しないことが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
好中球細胞外トラップ（NETs）現象のin vitro検出法として、蛍光顕微鏡による観察、二本鎖DNA定量による定量的NETs観察法を併用しながら、フローサイトメトリーによるNETs検出を検討した。その結果、現在までは、フォルボールエステルによるNET形成条件での検討ではあるが、現在使用中の浸透圧、および界面活性剤を用いて検出できる細胞集団は、NETs形成中の細胞である可能性が高いと考えられる。
なお、浸透圧条件については20以上、界面活性剤については種々の濃度で5種類以上の試薬の有用性について検討した。
ヘミンにより生成されるNETsは、フォルボールエステルによるものとは異なるものである可能性が高い。その理由は、形態学的な相違、抗酸化剤、ことにMito-TEMPOに対する動態、に大きな相違が存在するからである。従って、フォル－ボールエステルでのみ有用な方法であっても臨床的な価値は無いので、様々な条件での検討が必要であると考えられる。しかしながら、フォルボールエステルでの経験から、同様の検討により条件を設定できるのではないかと期待している。
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| 今後の研究の推進方策 |
フローサイトメトリーでのNETs検出系確立をめざして、種々の条件でのin vitro NET形成法の結果を比較検討の予定である。その後、動物実験にとりかかり、主に重症感染症、重症肺障害実験系マウスを用いて、血液、肺胞洗浄液を検体として、dsDNA定量と同時にフローサイトメトリー法の定量測定を評価したいと考えている。
その後、自動血球計数器への応用の可能性について検討の予定である。
特殊なNETsかも知れないが、生体内でも生じている可能性の高いヘミン誘導性のNETs現象についても、動物実験を用いて in vivo で確認したい。
動物実験での有効性が確認されれば、共同研究による臨床検体での検討の予定である。これまでにも鉄キレート剤共同研究を行った、姫路医療センター、姫路日赤病院、高砂西部病院、赤穂中央病院、などとはすでに今後の可能性について論議しているところである。重症感染症を中心として、血漿dsDNAの定量と同時に、全血を用いたフローサイトメトリーによるNETs形成細胞の検出をこころみ、病態との関連を解析したい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
フローサイトメータ用試薬の購入を予定したが、期限内に納品が不可能であったため次年度購入予定とした。
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| 次年度使用額の使用計画 |
フローサイトメータ用試薬の購入費の一部とする。
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