抗癌治療後の男性生殖機能障害に対する漢方治療法の確立

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 15K08937
• 研究機関: 東京医科大学
• 研究代表者: 曲 寧 東京医科大学, 医学部, 講師 (70527952)
• 研究分担者: 伊藤 正裕 東京医科大学, 医学部, 主任教授 (00232471) ; 善本 隆之 東京医科大学, 医学部, 教授 (80202406)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: 精巣 / 放射線 / 漢方薬 / 精子形成 / セルトリ細胞 / マウス

研究実績の概要

昨年度、我々は男性不妊症治療において臨床的に有効性が確認されている漢方製剤の中からツムラ牛車腎気丸（TJ107）を選び、抗癌剤ブスルファンによるマウスの精子形成障害に対する有効な治療効果を確認した。平成28年度は放射線によるマウスの精子形成障害に対するTJ107の効果を精巣・精巣上体の組織学的解析により検討した。4週齢C57BL/6j雄マウスに放射線6Gyを1回照射し、照射後60日からTJ107を含め飼料を与えた群（TJ107飼料群）とTJ107を含めない通常の飼料を与えた群（通常飼料群）に分け、それぞれ60日間自由摂取させた。120日目で各群マウスの体重・精巣重量・精巣上体精子数と精巣内の細胞増殖・細胞死などを調べた。また正常雌マウスと交配させ、150日まで妊娠率と出産率を調べた。放射線照射後60日目マウスの精巣重量は減少し、120日目には漢方群と放射線群が回復しましたが、コントロール群より有意に低下しました。120日目漢方群の精巣上体精子数は放射線群の2倍になり、150日目は劇的な回復が見られた。また、放射線群の出産率40％に対して、漢方群には100％の出産が見えました。放射線群では生殖細胞に自己抗体が見られ、上皮タイト結合蛋白Claudin11の低下が示されました。漢方群ではClaudin11の低下や生殖細胞の抗体反応が見られませんでした。精巣内マクロファージを調べたところ、放射線群では萎縮した精細管の周囲にマクロファージが増えましたが、漢方群では精細管の回復と間質のマクロファージの低下が見られました。
以上の結果により、放射線照射後生殖細胞だけではなく、精細管内のセルトリ細胞のタイトジャンクションおよび間質に存在する精巣内マクロファージも影響されます。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

放射線照射マウスの造血機能障害を回復させる研究は漢方薬の効果を検討した報告がありましたが、放射線処置後の精子形成障害については有効な治療効果を持つ漢方薬の報告はまだありません。今年度の結果により放射線照射後のマウス精子形成障害に対して、牛車腎気丸が有効な治療効果を示すことを見出した。また、精巣内マクロファージの関与が明らかになって、精子形成改善に関与している精巣内免疫環境の変化と精子形成の機構解明に有用と考えられる。昨年度の結果を含め、化学療法や放射線療法の抗癌治療後の精子形成障害に対してTJ107は有効な治療効果が示されていました。

今後の研究の推進方策

精子形成に関連する精巣間質のライディッヒ細胞と精細管内のセルトリ細胞に対する抗癌治療の影響についてまだ報告が少ない。そこで、4週齡C57BL/6j雄マウスにブスルファン（40 mg/kg）を腹腔注射あるいは放射線6 Gy照射後、120日まで経時的に精巣からRNAを抽出し、生殖細胞やセルトリ細胞、ライディッヒ細胞の関連遺伝子（Germ cell: Tnp1, Spo11, Stra8; Sertoli cell: Amh, Aqp8, Cldn11, Clu, Ccnd2, Espn, Fyn, Inhba, Il1a, Rhox5, Testin, Sox9, Trf; Leydig cell: Hsd3b6, Star, Lhr, Pdgfa）について調べる。次に、経時的に精巣を摘出し電子顕微鏡切片を作成し、電子顕微鏡解析および免疫組織化学的解析により、ライディッヒ細胞やセルトリ細胞などの精巣組織の微細形態変化の観察を行う。
また、精巣内マクロファージの関与が明らかになって、精子形成改善に関与している精巣内免疫環境の変化と精子形成の機構を解明するため、精巣間質マクロファージの除去による精子形成改善効果を調べる。 FACS解析により、マクロファージの細胞数が増えていれば、次にクロドロン酸リポソームの投与によりマクロファージを除去し、精子形成への影響を検討し、マクロファージの関与について明らかにする。

次年度使用額が生じた理由

漢方薬の抗癌治療による精子形成障害の改善効果を調べるため、牛車腎気丸を含めた餌（ヒト投薬量を体重換算して1，3，5倍を餌に含有）を60日まで自由摂食させるのを予定していたが、昨年度の実験結果に参考したうえ、今年度は5倍牛車腎気丸餌のみを用いて放射線照射マウスの精子形成障害に実験した。また、漢方治療により形成されたマウス精子の妊性を調べるために、顕微授精を行う予定ですが、5倍牛車腎気丸餌投与群マウスは自然交配により100％の出産が見られた。そのため、顕微授精用の精子採取・精子卵子の培養やマニピュレータなどの器具に使用予定の金額が抑えられたことも理由に挙げられる。

次年度使用額の使用計画

次年度は、漢方薬の抗癌治療による精子形成障害に対する、ヒト投薬量を体重換算して１倍・３倍の牛車腎気丸餌による改善効果についても調べるため、未使用額はその経費に充てることとしたい。研究経費として平成29年度は総額1696千円の研究経費を計上した。１倍・３倍牛車腎気丸餌と5倍牛車腎気丸餌の精子形成改善について比較検討するため、実験動物のためのマウス代（食餌含）600千円として使用予定である。また、消耗品として包埋剤・プラスチック・ガラス器具350千円、分子生物・生化学関連試薬および免疫・組織学関連試薬（抗体、ELISAやリアルタイムRT-PCR関連試薬、マイクロアレイや2次元電気泳動関連試薬）746千円として使用する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Specific autoantigens identified by sera obtained from mice that are immunized with testicular germ cells alone. (2016)
  • 著者名/発表者名: 1.Terayama H, Hirai S, Naito M, Qu N, Katagiri C, Nagahori K, Hayashi S, Sasaki H, Moriya S, Hiramoto M, Miyazawa K, Hatayama N, Li Z, Sakabe K, Matsushita M, Itoh M
  • 雑誌名: Sci Rep 18;6:35599, 2016 巻: 28 ページ: 6:35599
  • DOI: doi: 10.1038/srep35599.
  • 査読あり
• [学会発表] Goshajinkigan recover the intact spermatogenesis in busulfan-induced aspermatogenesis in mice (2017)
  • 著者名/発表者名: Ning Qu, Miyuki Kuramasu, Kenta Nagahori, Yoshie Hirayanagi, Shogo Hayashi, Yuki Ogawa, and Masahiro Itoh
  • 学会等名: 第122回日本解剖学会総会・全国学術集会
  • 発表場所: 長崎
  • 年月日: 2017-03-28 – 2017-03-30
• [学会発表] 放射線処置マウスの精子形成傷害における牛車腎気丸の治療効果 (2016)
  • 著者名/発表者名: 曲 寧, 高橋 薫平 , 永堀 健太 , 倉升 三幸 , 平栁 淑恵 , 平井 宗一 , 林 省吾 , 宮宗 秀伸 , 李 忠連 , 小川 夕輝 , 伊藤 正裕
  • 学会等名: 第31回日本生殖免疫学会学術集会
  • 発表場所: 兵庫
  • 年月日: 2016-12-02 – 2016-12-03
• [学会発表] EAO血清抗体に特異的に反応する自己抗原タンパク質の同定 (2016)
  • 著者名/発表者名: 永堀 健太, 平井 宗一 , 寺山 隼人 , 倉升 三幸 , 曲 寧 , 宮宗 秀伸 , 李 忠連 , 小川 夕輝 , 林 省吾 , 伊藤 正裕
  • 学会等名: 第31回日本生殖免疫学会学術集会
  • 発表場所: 兵庫
  • 年月日: 2016-12-02 – 2016-12-03