研究課題
エストロジェンは脳内において性腺刺激ホルモン放出ホルモン（GnRH）および黄体形成ホルモン（LH）のサージ状分泌の制御に第一義的役割を果たす。本研究では、新規ゲノム編集技術とアデノ随伴ウィルス（AAV）ベクターを活用する新たなアプローチにより、エストロジェン受容体（ER）の発現をコンディショナルにノックアウトする遺伝子改変ヤギを作出し、反芻家畜の排卵を制御する神経機構の局在を同定することを目的とする。ゲノム編集技術（TALEN法またはCRISPR/Cas9システム）を用いて、ヤギER遺伝子（ESR1）座にloxP配列を導入した遺伝子改変ヤギ（ESR1-floxedヤギ）を作出するため、ヤギESR1プロモーター領域およびESR1転写調節因子の探索を目的としてヤギESR1のゲノム構造を明らかにすることに着手した。シバヤギ血液から採取したゲノムDNAサンプルを用いて、ゲノムウォーキング法によりヤギESR1上流域の解析を続けている。また、AAVベクターを用いた遺伝子改変技術に適用するため、ヤギ脳内局所にAAV-Creを投与する手法の開発を行った。脳定位固定装置と、X線撮影による脳室造影画像を用いて、ERが発現する視索前野、視床下部腹内側核、視床下部弓状核などをターゲットとして、微量投与用のガイドカニューレを留置する条件検討を行った。この手法により、オスヤギの両側の視索前野にエストロジェン結晶を微量留置したところ、サージ様のLH分泌が誘起されたことから、視索前野への微量投与法についてはおおよその手法を確立することができた。さらに、AAV-Creをヤギ脳組織に導入するために最適なAAV血清型について検討を続けている。
3: やや遅れている
本年度の研究計画では、ヤギ胎仔繊維芽細胞を用いてTALEN法またはCRISPR/Cas9システムによる相同組み換えを利用して、ESR1遺伝子座にloxP配列を導入した細胞系の樹立を行うことを予定していた。しかし、ヤギESR1のゲノム構造情報を取得するのに時間を要していることから、細胞系の樹立には至らなかった。さらに、AAV-Creを導入するために最適なAAVベクターの血清型の同定まで到達できなかったが、他の遺伝子導入に際して導入効率が良いことを確認している血清型（AAV-1、AAV-5、AAV-DJなど）の情報を活用し、次年度には同定をめざす予定である。また、AAV-Creを脳内微量注入するためのヤギ脳内局所に投与する手法の開発はおおむね順調に推移したと考えている。
本研究では、ゲノム編集技術によりヤギESR1遺伝子座にloxP配列を導入した細胞系を樹立した後に、体細胞クローン技術を利用してESR1遺伝子座にloxP配列を導入した遺伝子改変ヤギ（ESR1-floxedヤギ）を作出し、さらにCre/loxPシステムによりコンディショナルにESR1をノックアウトして卵胞嚢腫モデルヤギを確立することをめざしている。それぞれの技術をヤギに適用する手法は確立されつつあり、今後は卵胞嚢腫モデルヤギの確立に全力を挙げる。また、ヤギ脳内局所にAAV-Creを投与する手法の開発を通じて、視索前野、視床下部腹内側核、視床下部弓状核などをターゲットとして、微量投与用のガイドカニューレを留置することが可能になったため、ESR1-floxedヤギの作出に並行して、エストロジェン結晶をヤギ脳内局所に微量留置してLHサージの誘起の有無を検証することにより、反芻家畜の排卵を制御するLHサージ制御機構の局在を探索することを試みる。
平成27年度はヤギESR1のゲノム構造情報を取得するのに時間を要していること、また、AAV-Creを導入するために最適なAAVベクターの血清型の同定実験が完了せず、実験進行中であることから、遺伝子関連実験用試薬や一般実験消耗品類の購入費が予想以上に少なくなったため、次年度使用額として約83万円を計上することとなった。
平成28年度は、ヤギESR1上流域の解析によるヤギESR1プロモーター領域およびESR1転写調節因子の探索を完了することや、AAV-Creを導入するために最適なAAVベクターの血清型の同定を最優先に取り組む。平成28年度に請求予定の次年度使用額とあわせた学術研究助成基金助成金約170万円は、そのための遺伝子実験・細胞生物学実験用試薬類、プラスチック消耗品類などの実験用資材の調達に使用し、本研究計画を円滑に推進するために有効に活用する。
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Journal of Neuroendocrinology
巻: 27 ページ: 57-65
10.1111/jne.12235
