| 研究課題/領域番号 |
15K21165
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| 研究機関 | 奈良先端科学技術大学院大学 |
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研究代表者 |
那須野 亮 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助教 (90708116)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | タンパク質ニトロ化 / 酵母 / グルタミン合成酵素 / チロシン残基 |
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| 研究実績の概要 |
前年度の結果より、酵母は遊離3-ニトロチロシン（3NT）をチロシンへ変換する活性を持たないと考えられた。一方、グルタミン合成酵素（GS）は、ニトロ化により活性が阻害されることが、哺乳類や植物で報告されている。また、哺乳類細胞由来の脱ニトロ化酵素活性は、GSのニトロ化修飾を除去することが報告されている。そこで、GSのニトロ化、および酵素活性を指標に、酵母脱ニトロ化酵素を探索した。まず、酵母GSであるGln1を、大腸菌を用いた組換えタンパク質として精製した。また、哺乳類・植物でニトロ化が報告されているチロシン残基は、酵母Gln1においても保存されていたため、これらをフェニルアラニンに置換した変異体を構築し、同様に精製した。また、マラカイトグリーンを用いたリン酸の定量により、簡便にGln1活性を測定する系を確立した。さらに、野生型のGln1をパーオキシナイトライト（PN）処理によりニトロ化したところ、活性が顕著に低下することが分かった。以上のことから、酵母GSにおいても、ニトロ化による酵素活性の抑制が観察された。
一方、細胞内のタンパク質がよりニトロ化される条件では、脱ニトロ化酵素活性が上昇すると考え、人工的に細胞内タンパク質のニトロ化レベルを上げることを試みた。まず、PNドナーであるSIN-1を酵母に処理したが、細胞内ニトロ化レベルの上昇は、コントロール条件と比べて軽微であった。しかし、酸性条件の亜硝酸添加培地に過酸化水素を加えて処理することで、細胞内ニトロ化レベルが著しく上昇した。今後は、この条件で処理した細胞から、脱ニトロ化酵素活性を探索することを考えている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
前年度の結果から、遊離3NTを用いた脱ニトロ化酵素の探索が困難と判明したため、生化学的に脱ニトロ化酵素を探索することを試みた。本研究計画では、酵母GSであるGln1のニトロ化、および酵素活性を指標に脱ニトロ化酵素を探索することを計画しているが、そのためには簡便で、かつ安定・高再現性の活性測定系が必要となる。本年度は、安定で再現性の高い、かつ簡便なGSの活性測定系の構築に手間取った。また、PN処理はある程度のレベルの手技を要求するため、これをクリアするプロトコルを構築するのに時間を要した。これらが、進行を遅らせている原因である。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、酵母Gln1のニトロ化・酵素活性を指標に、ニトロ化条件で処理した酵母の抽出液から、生化学的に脱ニトロ化酵素活性を検出し、これを同定する。これまでは、精製した野生型Gln1をPN処理によってニトロ化したものを用いていたが、PN処理はニトロ化だけでなく、酸化等ほかの修飾も引き起こす。そこで、大腸菌を用いた系によりニトロチロシンを人工的にチロシン部位に取り込ませたニトロ化Gln1を発現・精製し、これを用いる。以降の解析は、申請書の研究計画に従って行う。
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