物理化学的理解に基づく蛋白質間相互作用プロセス制御剤の探索と設計

2017 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 16H02420
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 津本 浩平 東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 教授 (90271866)
• 研究分担者: 長門石 曉 東京大学, 医科学研究所, 特任准教授 (30550248) ; CAAVEIRO Jose 九州大学, 薬学研究院, 准教授 (00536732)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: 創薬 / 蛋白質 / 低分子 / 抗体 / 物理化学

研究実績の概要

今年度は、モデルVHH, scFv抗体について、その抗原結合に関する物理化学的パラメータ（熱力学、速度論、熱安定性）を収集した。VHH抗体ではアラニンスキャニングを実施し、Hot Spot探索や親和性貢献に関する各アミノ酸の加算性などについて詳細な解析を行った。その結果、同じ抗原でもエピトープの違いや抗体の可変領域の1次配列の相違により、熱力学パラメータ、特に遷移状態に関する物理化学的性質が異なることが明らかとなった。またscFv抗体では、熱安定性と結合親和性に関する相関関係の議論や（J. Biochem. 2017, 162(4):255-258）、標的蛋白質との結合における熱力学解析と阻害能について成果を出すことに成功した（Sci. Rep. 2017, 7:39518.）。またVHH抗体のファージディスプレイライブラリーを構築し、リゾチーム蛋白質、インターロイキン受容体、病原性微生物表層蛋白質などの抗原に対するVHH抗体の取得に成功した。
一方で低分子においては、モデル蛋白質と低分子薬剤について、その相互作用に関する物理化学的パラメータ（熱力学、速度論）を収集した。具体的には、キナーゼ等の酵素と既知阻害剤との結合に関するITCやSPRを用いた精密な相互作用解析を実施し、遷移状態に関する議論に展開することができた。またがん関連、病原性微生物関連など蛋白質―蛋白質間相互作用PPIに関する精密な相互作用解析を行い（Biochem Biophys Res Commun. 2017, 493(2):1109-1114.）、これらに対する阻害剤スクリーニングを実施し、ヒット化合物の取得に成功した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

抗体のファージディプレイ、低分子化合物のスクリーニング、共に標的蛋白質に結合する分子を取得することが出来ている。そのうち目的の阻害活性を示す抗体、低分子化合物も選抜できており、おおむね研究計画は順調に進んでいる。

今後の研究の推進方策

＜抗体の相互作用解析と探索＞
ファージディスプレイによる取得したVHH抗体に関する特異性評価として、等温滴定型熱量計、表面プラズモン共鳴による熱力学・速度論解析を実施する。その際に抗体自身の物性も解析する。具体的には、示差走査型熱量計、示差走査型蛍光法、円偏光二色性スペクトル、多角度光散乱法などを活用して、抗体の熱安定性、フォールディング状態などを評価し、抗体として安定な物性を示すものを選択する。選択された抗体は抗原との複合体に関するX線結晶構造解析を実施することにより、アミノ酸レベルでの特異性創出メカニズムを解明する。その際に、計算化学を導入することにより、親和性向上、安定性向上につながる分子設計案を得ることを試みる。
＜低分子化合物の相互作用解析と探索＞
低分子化合物スクリーニングによる取得した低分子阻害剤に関する特異性評価として、こちらも等温滴定型熱量計、表面プラズモン共鳴による熱力学・速度論解析を実施する。また低分子結合に伴う標的蛋白質の物性評価も行う。具体的には、示差走査型熱量計、示差走査型蛍光法、円偏光二色性スペクトル、多角度光散乱法などを活用して、低分子結合に伴う標的蛋白質の物性変化を詳細に解析する。選抜されたヒット化合物との標的蛋白質との複合体に関するX線結晶構造解析を実施することにより、アミノ酸レベルでの特異性創出メカニズムを解明する。これより高い阻害活性を示す低分子設計に関する知見を収集し、低分子化合物の有機合成による構造展開、ドッキングによる構造設計も検討する。

研究成果

• [雑誌論文] Repertoire Analysis of Antibody CDR-H3 Loops Suggests Affinity Maturation Does Not Typically Result in Rigidification. (2018)
  • 著者名/発表者名: Jeliazkov JR, Sljoka A, Kuroda D, Tsuchimura N, Katoh N, Tsumoto K, Gray JJ.
  • 雑誌名: Front. Immunol. 巻: 9 ページ: 413
  • DOI: 10.3389/fimmu.2018.00413.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Assessing the Heterogeneity of the Fc-Glycan of a Therapeutic Antibody Using an engineered FcγReceptor IIIa-Immobilized Column. (2018)
  • 著者名/発表者名: Kiyoshi M, Caaveiro JMM, Tada M, Tamura H, Tanaka T, Terao Y, Morante K, Harazono A, Hashii N, Shibata H, Kuroda D, Nagatoishi S, Oe S, Ide T, Tsumoto K, Ishii-Watabe A.
  • 雑誌名: Sci. Rep. 巻: 8 ページ: 3955
  • DOI: 10.1038/s41598-018-22199-8
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Synergistic Cytotoxic Effect on Gastric Cancer Cells of an Immunotoxin Cocktail in Which Antibodies Recognize Different Epitopes on CDH17. (2018)
  • 著者名/発表者名: Kusano-Arai O, Iwanari H, Kudo S, Kikuchi C, Yui A, Akiba H, Matsusaka K, Kaneda A, Fukayama M, Tsumoto K, Hamakubo T.
  • 雑誌名: Monoclon. Antib. Immunodiagn. Immunother. 巻: 37 ページ: 1-11
  • DOI: 10.1089/mab.2017.0043
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structures of the prefusion form of measles virus fusion protein in complex with inhibitors. (2018)
  • 著者名/発表者名: Hashiguchi T, Fukuda Y, Matsuoka R, Kuroda D, Kubota M, Shirogane Y, Watanabe S, Tsumoto K, Kohda D, Plemper RK, Yanagi Y.
  • 雑誌名: Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 巻: 115 ページ: 2496-2501
  • DOI: 10.1073/pnas.1718957115
  • 査読あり
• [雑誌論文] A secondary RET mutation in the activation loop conferring resistance to vandetanib. (2018)
  • 著者名/発表者名: Nakaoku T, Kohno T, Araki M, Niho S, Chauhan R, Knowles PP, Tsuchihara K, Matsumoto S, Shimada Y, Mimaki S, Ishii G, Ichikawa H, Nagatoishi S, Tsumoto K, Okuno Y, Yoh K, McDonald NQ, Goto K.
  • 雑誌名: Nature Commun. 巻: 9 ページ: 625
  • DOI: 10.1038/s41467-018-02994-7
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Enzymatically cleavable traceless biotin tags for protein PEGylation and purification. (2018)
  • 著者名/発表者名: Wawro AM, Aoki Y, Muraoka T, Tsumoto K, Kinbara K
  • 雑誌名: Chem. Commun. 巻: 54 ページ: 1913-1916
  • DOI: 10.1039/c7cc05814d
  • 査読あり
• [雑誌論文] Production and characterization of a novel site-specific-modifiable anti-OX40-receptor single-chain variable fragment for targeted drug delivery. (2018)
  • 著者名/発表者名: Tanabe A, Nakano K, Nakakido M, Nagatoishi S, Tanaka Y, Tsumoto K, Uchimaru K, Watanabe T.
  • 雑誌名: Biochem. Biophys. Res. Commun. 巻: 496 ページ: 614-620
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2018.01.051
  • 査読あり
• [雑誌論文] PRDM14 directly interacts with heat shock proteins HSP90α and glucose-regulated protein 78. (2018)
  • 著者名/発表者名: Moriya C, Taniguchi H, Nagatoishi S, Igarashi H, Tsumoto K, Imai K
  • 雑誌名: Cancer Sci. 巻: 109 ページ: 373-383
  • DOI: 10.1111/cas.13458
  • 査読あり
• [雑誌論文] Thermodynamic analyses of amino acid residues at the interface of an antibody B2212A and its antigen roundabout homolog 1. (2017)
  • 著者名/発表者名: Yui A, Akiba H, Kudo S, Nakakido M, Nagatoishi S and Tsumoto K
  • 雑誌名: J. Biochem. 巻: 162 ページ: 255-258
  • DOI: 10.1093/jb/mvx050
  • 査読あり
• [雑誌論文] Analysis of Pore Formation and Protein Translocation Using Large Biological Nanopores. (2017)
  • 著者名/発表者名: Watanabe H, Gubbiotti A, Chinappi M, Takai N, Tanaka K, Tsumoto K and Kawano R
  • 雑誌名: Anal. Chem. 巻: 89 ページ: 11269-11277
  • DOI: 10.1021/acs.analchem.7b01550
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structure of the triose-phosphate/phosphate translocator reveals the basis of substrate specificity. (2017)
  • 著者名/発表者名: Lee Y, Nishizawa T, Takemoto M, Kumazaki K, Yamashita K, Hirata K, Minoda A, Nagatoishi S, Tsumoto K, Ishitani R and Nureki O.
  • 雑誌名: Nature Plants. 巻: 3 ページ: 825-832
  • DOI: 10.1038/s41477-017-0022-8
  • 査読あり
• [雑誌論文] Polymeric SpyCatcher Scaffold Enables Bioconjugation in a Ratio-Controllable Manner. (2017)
  • 著者名/発表者名: Jia L, Minamihata K, Ichinose H, Tsumoto K and Kamiya N
  • 雑誌名: Biotechnol. J. 巻: 12 ページ: 1700195
  • DOI: 10.0002/boit.201700195
  • 査読あり
• [雑誌論文] Biophysical characterization of the interaction between heme and proteins responsible for heme transfer in Streptococcus pyogenes. (2017)
  • 著者名/発表者名: Hoshino M, Nakakido M, Nagatoishi S, Aikawa C, Nakagawa I and Tsumoto K.
  • 雑誌名: Biochem. Biophys. Res. Commun. 巻: 493 ページ: 1109-1114
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2017.09.055
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structural basis for binding and transfer of heme in bacterial heme-acquisition systems. (2017)
  • 著者名/発表者名: Naoe Y, Nakamura N, Rahman MM, Tosha T, Nagatoishi S, Tsumoto K, Shiro Y and Sugimoto H
  • 雑誌名: Proteins 巻: 85 ページ: 2217-2230
  • DOI: 10.1002/prot.25386
  • 査読あり
• [雑誌論文] Elucidation of potential sites for antibody engineering by fluctuation editing. (2017)
  • 著者名/発表者名: Yanaka S, Moriwaki Y, Tsumoto K and Sugase K.
  • 雑誌名: Sci. Rep. 巻: 7 ページ: 9597
  • DOI: 10.1038/s41598-017-10246-9
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Use of SpyTag/SpyCatcher to construct bispecific antibodies that target two epitopes of a single antigen. (2017)
  • 著者名/発表者名: Yumura K, Akiba H, Nagatoishi S, Kusano-Arai O, Iwanari H, Hamakubo T, Tsumoto K.
  • 雑誌名: J. Biochem. 巻: 162 ページ: 203-210
  • DOI: 10.1093/jb/mvx023
  • 査読あり
• [雑誌論文] Haemolytic actinoporins interact with carbohydrates using their lipid-binding module. (2017)
  • 著者名/発表者名: Tanaka K, Caaveiro JMM, Morante K and Tsumoto K.
  • 雑誌名: Philos. Trans. R. Soc. B. 巻: 372 ページ: 20160216
  • DOI: 10.1098/rstb.2016.0216
  • 査読あり
• [雑誌論文] Functional Contacts between MPER and the Anti-HIV-1 Broadly Neutralizing Antibody 4E10 Extend into the Core of the Membrane. (2017)
  • 著者名/発表者名: Rujas E, Insausti S, Garcia-Porras M, Sanchez-Eugenia R, Tsumoto K, Nieva JL, Caaveiro JM
  • 雑誌名: J. Mol. Biol. 巻: 429 ページ: 1213-1226
  • DOI: 10.1016/j.jmb.2017.03.008
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Improved Brain Expression of Anti-Amyloid β scFv by Complexation of mRNA Including a Secretion Sequence with PEG-based Block Catiomer. (2017)
  • 著者名/発表者名: Perche F, Uchida S, Akiba H, Lin CY, Ikegami M, Dirisala A, Nakashima T, Itaka K, Tsumoto K and Kataoka K.
  • 雑誌名: Curr. Alzheimer Res. 巻: 14 ページ: 295-302
  • DOI: 10.2174/1567205013666161108110031
  • 査読あり
• [雑誌論文] Insight in the Evolution of Therapeutic Monoclonal Antibodies-Fundamental Technologies for Creation and Evaluation of Next Generation mAbs. (2017)
  • 著者名/発表者名: Ishii-Watabe A, Tsumoto K.
  • 雑誌名: Yakugaku Zasshi 巻: 137 ページ: 815-816
  • DOI: 10.1248/yakushi.16-00252-F.
• [学会発表] 分子シミュレーションと物理化学解析による抗体の熱安定性に関する研究 (2018)
  • 著者名/発表者名: 河上恵理、黒田大祐、中木戸誠、津本浩平
  • 学会等名: 日本化学会第98春季年会2018
• [学会発表] Structural, physicochemical and computational analysis to reveal the mechanism of recognition of phosphorylated antigen by an antibody (2018)
  • 著者名/発表者名: KAWADE, Raiji、AKIBA, Hiroki; NAKAKIDO, Makoto; KURODA, Daisuke; MARUYAMA, Toshiaki; OKUMURA, Shigeru; ENTZMINGER, Kevin; CAAVEIRO, Jose; TSUMOTO, Kouhei
  • 学会等名: 日本化学会第98春季年会2018
• [学会発表] Recent progress the analytical solutions for bio-pharmacentics (2017)
  • 著者名/発表者名: 津本浩平
  • 学会等名: APPA2017
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Recent Analytical Solutions for Bio-pharmaceutical Practice (2017)
  • 著者名/発表者名: 津本浩平
  • 学会等名: PITCON 2018
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 蛋白質相互作用の物理化学解析に基づくリガンドスクリーニング (2017)
  • 著者名/発表者名: 津本浩平, 長門石曉
  • 学会等名: 日本化学会第98春季年会2018
  • 招待講演
• [学会発表] 蛋白質相互作用解析が拓く革新的次世代創薬 (2017)
  • 著者名/発表者名: 津本浩平
  • 学会等名: 第15回RCGMフロンティアシンポジウム
  • 招待講演
• [学会発表] 分析技術が拓く次世代バイオ医薬品開発研究 (2017)
  • 著者名/発表者名: 津本浩平
  • 学会等名: 一般社団法人日本分析機器工業会, 日本科学機器協会 / JASIS 2017
  • 招待講演
• [学会発表] 蛋白質相互作用の熱力学解析と創薬 (2017)
  • 著者名/発表者名: 津本浩平, 長門石曉
  • 学会等名: 日本ケミカルバイオロジー学会第12回年会
  • 招待講演
• [学会発表] 物理化学的アプローチによる蛋白質間相互作用阻害剤の探索 (2017)
  • 著者名/発表者名: 長門石曉, 津本浩平
  • 学会等名: 第65回質量分析総合討論会
  • 招待講演
• [学会発表] 熱分析から低分子薬剤の探索・設計に挑む (2017)
  • 著者名/発表者名: 長門石曉, Caaveiro Jose, 津本浩平
  • 学会等名: 第30回九州分析化学若手の会 春の講演会
  • 招待講演
• [学会発表] hermodynamic elucidation of binding process for protein-ligand interactions to propose a drug design (2017)
  • 著者名/発表者名: Satoru Nagatoishi, Kouhei Tsumoto
  • 学会等名: 第55回日本生物物理学会年会
• [学会発表] シクロオレフィンポリマーCOP表面に対するホフマイスター効果に依存したタンパク質吸着制御 (2017)
  • 著者名/発表者名: 長門石曉、藤田梨紗子、足達慧、西岡寛哉、二宮英隆、彼谷高敏、高井まどか、津本浩平
  • 学会等名: 第11回バイオ関連化学シンポジウム
• [学会発表] 低分子創薬の技術開発における物理化学バリデーション (2017)
  • 著者名/発表者名: 長門石曉、津本浩平
  • 学会等名: 第30回バイオメディカル分析科学シンポジウム
• [学会発表] 天然変性蛋白質Mint3とFIH-1の相互作用解析におけるH/D交換質量分析法の適用 (2017)
  • 著者名/発表者名: 展 天承、中山 佳昭、長門石 曉、坂本 毅治、清木 元治、津本 浩平
  • 学会等名: 第65回質量分析総合討論会
• [学会発表] 結晶構造と変異導入解析によるウサギ抗体のリン酸基認識機構の解明 (2017)
  • 著者名/発表者名: 河出 来時、秋葉 宏樹、カアベイロ ホセ、奥村 繁、丸山 俊昭、Kevin Entzminger 、 津本 浩平
  • 学会等名: 第17回日本蛋白質科学会年会
• [学会発表] 抗原ペプチドの硫酸化がペプチド－抗体間相互作用に与える影響の熱力学的解析 (2017)
  • 著者名/発表者名: 宮鍋 一紘、秋葉 宏樹、高松 佑一郎、 山下 雄史、カアベイロ ホセ、津本 浩平
  • 学会等名: 第55回日本生物物理学会年会
• [学会発表] 抗原配列の硫酸化が抗体との相互作用に与える影響の熱力学的解析 (2017)
  • 著者名/発表者名: 宮鍋一紘、秋葉宏樹、カアベイロホセ、黒田大祐、中木戸誠、高松佑一郎、山下雄史、津本浩平
  • 学会等名: 第11回バイオ関連化学シンポジウム
• [学会発表] Thermodynamic analysis of the effect of sulfation on a peptide-antibody interaction (2017)
  • 著者名/発表者名: 宮鍋一紘、秋葉宏樹、高松佑一郎、山下雄史、カアベイロホセ、津本浩平
  • 学会等名: 第55回日本生物物理学会年会
• [学会発表] ホモ2量体形成蛋白質P-cadherinを標的とした蛋白質間相互作用阻害剤の探索 (2017)
  • 著者名/発表者名: 妹尾暁暢、田島卓実、工藤翔太、長門石曉、津本浩平
  • 学会等名: 2017年度生命科学系学会合同年次大会
• [図書] CSJカレントビュー 医療・診断・創薬の化学 医療応用のための物理化学 (2017)
  • 著者名/発表者名: 津本浩平、長門石曉（分担執筆）
  • 総ページ数: 6
  • 出版者: 化学同人
• [図書] 生体分子化学 8章 酵素 (2017)
  • 著者名/発表者名: 長門石曉、津本浩平（分担執筆）
  • 総ページ数: 27
  • 出版者: 講談社
• [備考] 分子標的治療薬に対するがんの新しい薬剤耐性メカニズムを発見
  • URL: https://www.t.u-tokyo.ac.jp/foe/press/setnws_201802141404181716288876.html
• [備考] 葉緑体から光合成産物を運び出すメカニズムを解明
  • URL: https://www.s.u-tokyo.ac.jp/ja/press/2017/5576/