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2017 年度 実績報告書

核内小分子RNAの作用メカニズムの解明

研究課題

研究課題/領域番号 16H06159
研究機関東京大学

研究代表者

岩川 弘宙  東京大学, 定量生命科学研究所, 助教 (60710415)

研究期間 (年度) 2016-04-01 – 2019-03-31
キーワードRNAサイレンシング / RNA-DNAハイブリッド / siRNA
研究実績の概要

平成29年度から平成30年度8月にかけ大きく分けて3つの実験を実施した。以下にその概要を記す。
1.試験管内で小分子RNA依存的にDNAメチル化を促進する新規実験系を作成するため、DNAメチルトランスフェラーゼ(DRM2)および、メチル化補助因子の発現及び精製を行った。当初シロイヌナズナのAtDRM2を作成したが活性がなかったため、タバコ由来のDRM2(NtDRM2)の発現・精製を試みた。メチル化補助因子に関してはAtDRM2と相互作用が認められているAtRDM1とAtDRM2のホモログであるAtDRM3の発現・精製を行った。
2.リコンビナントのDRM2と、タバコ培養細胞抽出液(BYL)で発現し精製したAGO4を用いて相互作用解析を行った。その結果ネガティブコントロールであるLacZやRlucに比べてAGO4はDRM2と強く相互作用することが明らかになった。また、この相互作用は標的核酸非依存的に起こることも明らかにした。
3.過去の知見から、DRM2の基質は2本鎖DNAであることが示唆されている。そこで、AGO4-RISC標的配列以外の部分が二本鎖になるような内部ループ構造をもつ標的DNAを作成し、その標的DNAがAGO4-RISCと結合できるのかをフィルターバインディングアッセイによって解析した。その結果、内部ループ二本鎖DNAはAGO4-RISCの非常に良い標的になることを明らかにした。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

試験管内小分子RNA依存的DNAメチル化系は完成こそしなかったものの、①再構成に必要な必須タンパク質の発現・精製、②AGO4-DRM2の直接相互作用の発見、③天然に近いDNA基質にAGO4-RISCが強く相互作用することを発見したため、研究はおおむね順調に進んでいると評価した。

今後の研究の推進方策

これまでの試験管内実験系を用いた研究結果より、24塩基の小分子RNAとAGO4、6、9から形成される3種類の核内RISCは、RNAよりDNAと強く結合することを見出している。一方で、21塩基の小分子RNAとAGO1およびAGO2から形成される細胞質RISCはDNAよりRNAと強く結合することを明らかにしている。これらの結果は、核内RISCが特異的にDNAと強く結合できることを示唆しているが、実際にDNAとの直接の結合が、DNAのメチル化に必要なのかは明らかになっていない。
この問題を解決するためには「標的RNAと強く結合するが、DNAとは結合しにくい核内RISCのDNAメチル化能」を調べることが鍵となると考えられる。21塩基の小分子RNAと結合する細胞質RISCはRNAを好む事から、21塩基の小分子RNAと核内AGOからRISCが形成されれば、DNAではなくRNAとの結合を好む核内RISCを作製できる可能性がある。しかしながら、そもそも、植物の核内AGOがどの様な効率で24塩基および21塩基の小分子RNAと結合するのか、また、どのタンパクドメインまたはモチーフが24塩基、21塩基の小分子RNAとの結合に重要な役割を果たしているのか、さらにはそのドメインを改変することで結合する小分子RNAの好みを改変することはできるのかなど不明な点が多い。今後は上記の問題を解決するため、核内AGOが取り込む小分子RNAの特徴を明らかにし、異なるAGO間でドメインスワッピングを行う予定である。

  • 研究成果

    (10件)

すべて 2018 2017 その他

すべて 雑誌論文 (4件) (うち査読あり 4件、 オープンアクセス 2件) 学会発表 (5件) (うち国際学会 4件) 備考 (1件)

  • [雑誌論文] In vitro RNA-dependent RNA Polymerase Assay Using Arabidopsis RDR62018

    • 著者名/発表者名
      Baeg Kyungmin、Tomari Yukihide、Iwakawa Hiro-oki
    • 雑誌名

      BIO-PROTOCOL

      巻: 8 ページ: _

    • DOI

      10.21769/BioProtoc.2673

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Silencing messages in a unique way2017

    • 著者名/発表者名
      Iwakawa Hiro-oki、Tomari Yukihide
    • 雑誌名

      Nature Plants

      巻: 3 ページ: 769~770

    • DOI

      10.1038/s41477-017-0028-2

    • 査読あり
  • [雑誌論文] In Vitro Analysis of ARGONAUTE-Mediated Target Cleavage and Translational Repression in Plants2017

    • 著者名/発表者名
      Tomari Yukihide、Iwakawa Hiro-oki
    • 雑誌名

      Methods in Molecular Biology

      巻: 1640 ページ: 55~71

    • DOI

      10.1007/978-1-4939-7165-7_4

    • 査読あり
  • [雑誌論文] 植物のRNAサイレンシング機構が自己のmRNAを攻撃しないメカニズム2017

    • 著者名/発表者名
      岩川 弘宙
    • 雑誌名

      BSJ-Review

      巻: 8 ページ: 58 ~70

    • DOI

      10.24480/bsj-review.8b4.00114.1

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] In vitro analysis of small RNA preference of ARGONAUTE 4 in Arabidopsis thaliana2018

    • 著者名/発表者名
      Wei Liu, Yukihide Tomari, Hiro-oki Iwakawa
    • 学会等名
      第59回日本植物生理学会年会
  • [学会発表] Plant ARGONAUTE4 family proteins prefer to bind to DNA targets in vitro2017

    • 著者名/発表者名
      Iwakawa HO, Tomari Y
    • 学会等名
      The 22nd Annual Meeting of the RNA Society
    • 国際学会
  • [学会発表] The poly(A) tail blocks RDR6 from converting self mRNAs into the substrates for gene silencing2017

    • 著者名/発表者名
      Baeg K, Iwakawa HO, Tomari Y
    • 学会等名
      The 22nd Annual Meeting of the RNA Society
    • 国際学会
  • [学会発表] Plant ARGONAUTE4 family proteins prefer to bind to DNA targets in vitro2017

    • 著者名/発表者名
      Iwakawa HO, Tomari Y
    • 学会等名
      12th Microsymposium on small RNA biology
    • 国際学会
  • [学会発表] The poly(A) tail blocks RDR6 from converting self mRNAs into the substrates for gene silencing2017

    • 著者名/発表者名
      Baeg K, Iwakawa HO, Tomari Y
    • 学会等名
      12th Microsymposium on small RNA biology
    • 国際学会
  • [備考] researchmap 岩川 弘宙

    • URL

      https://researchmap.jp/Hiro_Iwa/

URL: 

公開日: 2019-12-27  

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