研究課題
一般的な牛卵子の体外発育培養では、卵子顆粒層細胞複合体 (OGCs) を用いている。しかし、体内では卵胞外層に内卵胞膜細胞が存在し、これらから分泌されるホルモンおよび成長因子が不可欠であることが知られている。そこで、内卵胞膜細胞からのみ分泌され、体内での卵胞発育に従って発現が高まると報告され、顆粒層細胞の黄体化を抑制するコツ形成タンパク質(BMP)-4に着目し、実験を実施した。牛卵子発育培地へのBMP-4添加はOGCsの生存性を向上させ、無添加での培養期間を16日間に延長した場合、生存率が58.9%に低下するが、BMP-4添加では83.2%であり、12日間培養 (約85%) と同等の値を示した。また、BMP-4無添加では培養期間延長による卵子直径に変化が見られなかったが、BMP-4添加は卵子直径が増大させることが明らかになった。一方、胚盤胞への発生率は、培養期間の延長とともに低下したことから、BMP-4添加はOGCsの長期間培養による卵子発育を促進するが、その発生能は抑制することが推察された。以上から、BMP-4の添加は顆粒層細胞の黄体化を抑制することによってOGCsの生存性を向上させ、卵子の成長を促進する可能性を示した。しかし、BMP-4以外の因子が卵子の発生能獲得に関連している可能性が示されたことから、OGCsと内卵胞膜細胞の共培養法の開発に着手した。その結果、共培養した内卵胞膜細胞からアンドロステンジオン（A4）が分泌され、OGCsの発育を促進することが明らかになった。また、共培養によって発育した卵子を体外受精に供したところ、卵割した卵子の発生能は約30%であり、体内発育した卵子と同等であることを明らかにした。しかし、A4の分泌パターンおよびA4産生に関与するCYP17A1 mRNAの発現を確認したところ、培養4日目までに著しく低下していることを明らかにした。
2: おおむね順調に進展している
OGCsの培養において、エストラジオール17βの代わりにアンドロステンジオンを添加した培養にも取り組み、アロマーターゼをはじめとするステロイド合成酵素の分析を行っている。また、培養したOGCsの顆粒層細胞におけるLHレセプターの発現（卵胞成熟の指標）、Cyclin D2の発現（細胞分裂活性の指標）およびBaxやBCL-2の発現（アポトーシス関連遺伝子）について検討するため、材料を採取し、現在、検討を続けている。また、体外で培養したOGCsの正常性を確認するため、大学の付属農場で飼育しているホルスタイン牛にホルモン処理を施して発情周期を調整し、卵胞発育中期（選抜期）および後期（主席期）に超音波装置を用いた経腟採卵胞によって卵子-卵丘複合体および顆粒層細胞の採取を行っている。採取された卵胞液内のステロイドホルモン濃度を測定するとともに、顆粒層細胞機能について上述の項目を検査する予定である。また、購入した高解像度の超音波プローブを用いて、卵胞発育速度についても検討している。BMP-4添加培地を用いた培養期間の延長に関する研究およびアンドロステンジオン添加培地による卵子培養に関する研究は、それぞれ国際雑誌にアクセプトされ、もうすぐ公表される予定である。また、内卵胞膜細胞との共培養に関する研究についても論文を準備中である。しかし、野生動物に関しては、卵巣が手に入らず、現状では動物園に赴き雄動物からの精子の採取を行うとともに、体外受精に用いるための凍結方法の開発を実施している。
内卵胞膜細胞とOGCsの共培養は、ある程度卵子の発生能を向上させたが、10日以上の培養は内卵胞膜細胞のアンドロステンジオン産生能を低下させることが明らかになった。また、高い卵子発生能を獲得させるために必要な発育培地への牛血清の添加は、顆粒層細胞を黄体化させ、エストラジオール17βの分泌を低下させることも明らかになった。現在、無血清培地による全く新しい培養方法の開発に取り組むとともに、血清を添加しても顆粒層細胞の黄体化を誘起しない培養法の開発にも取り組んでいる。体内発育卵胞におけるステロイドホルモン分泌パターンや顆粒層細胞における各種遺伝子の発現パターンが明らかになれば、体外発育培養においても同様な発現パターンとなるような、ホルモンあるいは成長因子の添加方法について検討する予定である。問題点として、本年度からの急激な卵巣価格の高騰があげられる。研究計画を作成した一昨年までは1個50円であったのが、平成28年度から200円/個、平成29年度からは500円/個となった。これは当初の実験計画時の10倍の価格であり、使用できると場由来卵巣数が制限されることになる。今後は、と場卵巣を用いた実験数を減少させ、大学付属農場で飼育されている牛あるいは北海道内の他の研究施設で飼育されている牛を効率的に使用して実験を実施することを計画している。
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Animal Science Journal
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Theriogenology
10.1016/j.theriogenology.2017.04.030.
