神経疾患におけるRNAグアニン四重鎖複合体凝集機構の解明と創薬研究

2017 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K08265
• 研究機関: 岐阜薬科大学
• 研究代表者: 塩田 倫史 岐阜薬科大学, 薬学部, 准教授 (00374950)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: グアニン四重鎖 / 神経細胞 / 神経変性疾患

研究実績の概要

これまで、グアニン四重鎖構造認識単鎖可変領域フラグメント (BG4-scFv) を用いて生細胞のグアニン四重鎖構造の可視化に成功した。このグアニン四重鎖認識 scFv に FLAG タグを付加し哺乳類発現プラスミドでマウス神経芽細胞腫 Neuro-2a に発現させたところ、細胞核内に DNA 上のグアニン四重鎖として微小な粒子が観察され、さらに細胞質には RNA グアニン四重鎖構造/蛋白質複合体である比較的大きな顆粒が観察された。これらは、 DNase や RNase 処置によりそれぞれ消失することを確認できた。また、グアニン四重鎖構造の細胞内動態を生細胞観察するために EGFP を付加したが、構造変化が起こりグアニン四重鎖構造を正確に認識することができなかった。そのため、6 残基のアミノ酸 Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys 配列のテトラシステイン（TC）モチーフを挿入し、TC モチーフと結合し緑色蛍光を発する FlAsH を用いたところ、生細胞のグアニン四重鎖構造可視化に成功した。さらに、BG4-scFv によるマウス脳組織由来免疫沈降物に対して次世代 RNA シーケンサーと LC-MS/MS ショットガン解析を行い、マウス脳内のグアニン四重鎖構造/蛋白質複合体の構成成分を同定した。それら複合体には、これまでに報告がない新規グアニン四重鎖形成 mRNA 及び結合蛋白質が数種含まれていた。BG4-scFv を用いることで、グアニン四重鎖の細胞内局在や構成成分を明らかにできた。今後、人為的にグアニン四重鎖を酸化することで、マウス脳神経にどのような影響を及ぼすか検討する。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

今年度は、グアニン四重鎖の細胞内局在や構成成分を網羅的に明らかにできた。さらに、そのリストの蛋白質のひとつにおいてグアニン四重鎖との結合が確認できた。

今後の研究の推進方策

グアニン四重鎖と神経細胞障害との関与について検討することができる準備ができた。リストアップされた RNA グアニン四重鎖構造/蛋白質複合体の構成成分と脳神経における病態との関与を詳細に検討していく。

次年度使用額が生じた理由

概ね研究が順調に進んでおり、消耗品費が少額で済んだため。次段階の実験における研究費として使用する。

研究成果

• [雑誌論文] Targeting G-quadruplex DNA as cognitive function therapy for ATR-X syndrome. (2018)
  • 著者名/発表者名: Shioda N*., Yabuki Y., Yamaguchi K., Onozato M., Li Y., Kurosawa K., Tanabe H., Okamoto N., Era T., Sugiyama H., Wada T*., Fukunaga K*.
  • 雑誌名: Nature Medicine. 巻: in press ページ: in press
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Ouabagenin is a naturally occurring LXR ligand without causing hepatic steatosis as a side effect. (2018)
  • 著者名/発表者名: Tamura S., Okada M., Kato S., Shinoda Y., Shioda N., Fukunaga K., Ui-Tei K. and Ueda M*.
  • 雑誌名: Sci Rep. 巻: 8 ページ: 2305
  • DOI: 10.1038/s41598-018-20663-z.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Blockade of the KATP channel Kir6.2 by memantine represents a novel mechanism relevant to Alzheimer's disease therapy (2018)
  • 著者名/発表者名: Moriguchi S*., Ishizuka T., Yabuki Y., Shioda N., Sasaki Y., Tagashira H., Yawo H., Yeh J.,
  • 雑誌名: Molecular Psychiatry. 巻: 23 ページ: 211-221.
  • DOI: 10.1038/mp.2016.187.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Endocytosis following dopamine D2 receptor activation is critical for neuronal activity and dendritic spine formation via Rabex-5/PDGFRβ signaling in striatopallidal medium spiny neurons. (2017)
  • 著者名/発表者名: Shioda N*., Yabuki Y., Wang Y., Uchigashima M., Hikida T., Sasaoka T., Mori H., Watanabe M., Sasahara M. and Fukunaga K*.
  • 雑誌名: Molecular Psychiatry. 巻: 22 ページ: 1205-1222.
  • DOI: 10.1038/mp.2016.200.
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Physiological and Pathological Roles of CaMKII-PP1 Signaling in the Brain. (2017)
  • 著者名/発表者名: Shioda N*., Fukunaga K*.
  • 雑誌名: Int J Mol Sci. 巻: 19 ページ: pii: E20.
  • DOI: 10.3390/ijms19010020.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Dopamine D2L receptor-interacting proteins regulate dopaminergic signaling. (2017)
  • 著者名/発表者名: Shioda N*.
  • 雑誌名: J Pharmacol Sci. 巻: pii: S1347-8613 ページ: 30171-30178.
  • DOI: 10.1016/j.jphs.2017.10.002.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Involvement of G-quadruplexes in neurodegenerative diseases (2017)
  • 著者名/発表者名: Shioda N*
  • 雑誌名: Nihon Yakurigaku Zasshi 巻: 150 ページ: 298
  • DOI: 10.1254/fpj.150.298.
• [雑誌論文] RNA toxicity and RAN translation in repeat expansion disorders. (2017)
  • 著者名/発表者名: Shioda N*
  • 雑誌名: Nihon Yakurigaku Zasshi 巻: 150 ページ: 165
  • DOI: 10.1254/fpj.150.165.
• [学会発表] グアニン四重鎖を標的とした遺伝性神経疾患の病態解明 (2017)
  • 著者名/発表者名: 塩田倫史
  • 学会等名: 第60回日本神経化学会大会
• [学会発表] 脆弱X関連振戦／失調症候群（FXTAS）における RAN タンパク質 FMRpolyG の産生と病態との関与 (2017)
  • 著者名/発表者名: 塩田倫史
  • 学会等名: ConBio2017
• [学会発表] G-quadruplexes as a therapeutic target for ATR-X syndrome (2017)
  • 著者名/発表者名: 塩田倫史
  • 学会等名: 日本人類遺伝学会第62回大会
• [産業財産権] 神経障害を改善するための医薬組成物 (2017)
  • 発明者名: 石塚 昌宏、高橋 究、芳賀 直実、塩田 倫史
  • 権利者名: 石塚 昌宏、高橋 究、芳賀 直実、塩田 倫史
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 特願2017-122838