研究課題
我々はマウス転移モデルを開発し、がん転移を促進する分子候補の１つとしてEMU1を同定した。EMU1は生理的・病理的な働きや組織での発現分布について未解明の分子である。本研究では1) EMU1分子の働き、2) がん転移を促進する機序、3) EMU1の正常ヒト組織での発現分布やがんの悪性度との関わりについて明らかにする。これまでの研究により明らかとなったことは1)EMU1の機能：マウス乳がん細胞のEMU1発現を高めた実験において、EMU1タンパクは細胞外に分泌され、培養皿上に基質として沈着し、細胞の培養皿への接着を阻害した。また、がん細胞のEMU1発現を抑制すると、細胞の増殖性が顕著に低下した。このように、EMU1は細胞外で細胞の基質への接着を阻害する一方、細胞内では増殖を促進する、という２つの機能を持っていることが明らかになった。2)がん転移における役割：EMU1が転移を促進するか否かを検証するためには、長期間EMU1発現を亢進または抑制し続ける細胞を作る必要がある。高発現系として、低転移細胞に発現ベクターを導入し、安定した発現する細胞を作製した。また、発現抑制系は、CRISPR/Cas9システムを用いて、EMU1のノックアウト細胞を作製している。今後、これらの細胞をマウスに移植し、転移のアッセイを行う。3)EMU1のヒト正常・がん組織における発現：EMU1抗体を用いた免疫染色では、正常組織では胃底腺壁細胞、膵ランゲルハンス島β細胞にのみ発現が見られた。また、がん症例のmRNA発現解析では、EMU1の高発現は、全てのがんでは348/1440 (24%)、乳がん 39/89 (44%)、大腸がん 216/562 (38%) に見られた。
3: やや遅れている
平成29年度は、概要に示した3項目について研究を進め、また、派生項目として1項目を追加した。各項目の進行状況は以下の通り。1.タンパクの機能解析：EMU1が細胞外基質(ECM)に沈着し、反接着作用を示すメカニズム解明を目指した。ECM成分との結合能のアッセイで、EMU1はlaminin、特にAG73ペプチドへの結合能が高かったが、collagen I, IV, fibronectin への結合は低かった。免疫沈降法による網羅的な解析には至っていない。増殖促進作用については、EMU1強制発現系とノックダウン系の2つの実験系に共通して変化する遺伝子のデータからpathway解析を行った結果、細胞周期との関連が示された。2.がん転移促進の検証：EMU1発現の転移への作用をin vivoで検証するため、発現ベクターを用い、安定高発現細胞を作製した。また、shRNAベクターを用いてノックダウン安定細胞の作製を試みたが、十分な抑制効果を得られなかった。このため、CRISPR/Cas9システムを用いてEMU1のノックアウト細胞を作製中である。3.がん症例の予後との相関解析：静岡がんセンターで進行中のがんゲノム解析プロジェクト (project HOPE)のデータを用いて、各種がんのEMU1発現を解析した。全種類のがんでは348/1440 (24%)にEMU1の高発現が見られ、特に、乳がん 39/89 (44%)、大腸がん 216/562 (38%) に頻度が高かった。派生項目：正常組織での発現：EMU1タンパクは正常組織では胃底腺と膵島β細胞に特異的に発現する。インスリン分泌や糖尿病との関連を想定し、マウスやヒトの膵島組織のEMU1 cDNAを用いた解析を行っている。
平成28年度の研究成果をもとに以下の研究を推進する。1.がん転移との関連：高転移細胞にCRISPR/Cas9を導入し、EMU1遺伝子をノックアウトした細胞を作製する。このノックアウト細胞と前年度、低転移細胞に遺伝子導入して作製した安定高発現細胞を同系マウスに移植し、転移への影響を観察する。移植した腫瘍は組織学的に観察し、腫瘍の構築、増殖性、浸潤性、間質との相互関係、腫瘍血管などを検討する。これら細胞の悪性形質に関わる性質をin vitroでアッセイする。2.分子機能の解析：前年度、EMU1タンパクとの結合が見出されたlamininとの分子間相互作用の解析を進める。また、培養皿に沈着したEMU1が独特の形態を示すメカニズムを明らかにする。さらに、EMU1と他の接着分子や増殖に関わる分子との相互作用を明らかにするために、精製EMU1タンパクとEMU1抗体を用いて細胞抽出液から結合タンパクを免疫沈降し、質量分析により同定する。3.ヒトがんへの応用：前年度のproject HOPEのデータ解析から乳がん、大腸がんにEMU1高発現症例が多いことが明らかとなった。今年度はターゲットを乳がんに絞り、EMU1抗体を用いた免疫染色によりEMU1の発現と患者の予後や予後関連因子との関連を解析する。4.膵島細胞におけるEMU1分子の役割：膵島β細胞でのEMU1タンパク発現が高いことから、何らかの機能を有している可能性が考えられる。膵島細胞の分離培養やインスリノーマ細胞株の入手により、in vitroでの実験的解析を行う。
（理由）平成29年度はマウス乳癌細胞株のEMU1安定高発現または低発現細胞の作製に予定外に大幅な時間を費やしたため、動物実験に至らなかった。細胞の作製は既存の試薬で間に合ったため新たな購入は少額であり、さらに、実験動物の購入がなかったため、使用額が予定額よりも大幅に少なかった。また、EMU1結合タンパクの網羅的解析に必要な質量分析は受託解析として計画していたが、実験の遅れから次年度に行うことにした。（使用計画）平成30年度は新たな手法でEMU1遺伝子のノックアウトを行う計画であり、ベクターの受託合成のために50～100万円の予算が必要である。作製が完了した細胞は順次、SCIDマウスに移植して転移のアッセイをするため、実験動物購入費を次年度繰り越しとした。また、平成29年度に行う予定であった質量分析の受託解析費も次年度へ繰り越すこととした。
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