| 研究課題/領域番号 |
16K09860
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| 研究機関 | 藤田医科大学 |
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研究代表者 |
安部 明弘 藤田医科大学, 医学部, 客員准教授 (00432261)
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| 研究分担者 |
恵美 宣彦 藤田医科大学, 医学部, 教授 (30185144)
山本 幸也 藤田医科大学, 医学部, 准教授 (90410703)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 造血器腫瘍 / RNA-seq / 融合遺伝子 / 複雑核型 |
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| 研究実績の概要 |
1.昨年度に行った造血器腫瘍12検体におけるRNA-seqデータのコンピューター解析を進めた。RNA-seqは、Hiseq1500を用いRapidランモードで行い約6.6億リードを得た。解析はCLC genome workbenchを用いて、マッピングデータ、遺伝子変異解析、発現解析を行った。また、融合遺伝子はオープンソースの融合遺伝子解析ソフトTopHat-FusionとdeFuseにより解析を進め、得られたデータはエクセルにダウンロードしマクロ機能を用いて解析プログラムを作製し多面的な解析を行った。当研究課題にて、RNA-seq解析した症例数は24例、過去の検体を含めこれまでに50検体の造血器腫瘍を解析した。
2.エクセルにダウンロードしたデータにより、TPM(transcripts per kilobase million)による遺伝子発現を比較し、各遺伝子の発現順位をつけた。こうすることにより、造血器腫瘍において異所性発現を示す遺伝子の選別が容易になった。また、融合遺伝子解析ソフトは、有為ではない遺伝子も数多く抽出され異所性発現を示した遺伝子における融合遺伝子のデータと比較することにより遺伝子再構成による異所性発現遺伝子の同定することができた。
3.新規融合遺伝子の機能解析。TCF4-MAML3融合遺伝子の解析を行った。12番染色体に異常の見られた2症例から見出したETV6-IAPPおよびETV6-ABCC9融合遺伝子について、GFPとの融合遺伝子を作成しタンパクとしての発現解析を行った結果、ABCC9の発現は見られたがIAPPの発現は確認できなかった。そこで、ETV6-ABCC9の全長をクローニングし機能解析のため発現ベクターの作成を試みたが、大腸菌への毒性があると思われ、培養温度や大腸菌の種類を変える等を試みたが、トランスフォーマントは得られなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
1.昨年度中に行う予定であったRNA-seqは、目的に合ったサンプルの収集に時間がかかり予定が遅れたが、サンプル調整が終わり次世代シークエンサーでの解析を進めている。
2.遺伝子再構成による異所性遺伝子発現の解析。融合遺伝子の解析データと遺伝子発現の解析データを分析することで、異所性遺伝子発現を示す遺伝子を効率良く抽出することができた。これまでに異所性遺伝子発現として解析した、PDGFRα、GSX2、ABCC9、ARHGAP44なども容易に選別できた。この他にも、多数の異所性遺伝子発現を示す遺伝子が抽出されている。
3.複雑核型を示した症例における遺伝子変異に関する解析。新たな遺伝子変異の探索に取り組んでおり、幾つかの候補遺伝子について解析を進めている。この中で、ARID遺伝子群に散発的な変異が認められており注目している。
4.NK細胞性白血病において認められたTCF4-MAML3融合遺伝子の解析を進めている。遺伝子発現プロファイルの解析から、TCF4-MAML3を有する症例において、WNT関連遺伝子の発現増加が認められた。
5.ETV6-ABCC9融合遺伝子の機能解析。ABCC9は薬剤耐性遺伝子群に属するため、異所性発現による薬剤耐性化の可能性を考え、ETV6-ABCC9融合遺伝子の機能解析を進めるも発現ベクターの作成が困難であったため断念した。これも、研究遅延の原因の１つである。
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| 今後の研究の推進方策 |
1.現在、新たな造血器腫瘍14例で、RNA-seq解析を進めている。
2.これまでの解析で予想以上に多数の融合遺伝子が検出されているが、複数のコンピューターソフトを用いた解析結果を照合して検討するとともに、実在する可能性の高い融合遺伝子についてはPCR法などでの確認を行う。多症例での解析データに横断的に検討を加え、再現性のある異常についてエクセルのマクロ機能を使って統計処理するプログラム作成し統計的な解析をすすめる。また、コンピューター解析において、近隣に位置する二つの遺伝子間にスプライシングが生じた融合遺伝子が多数検出されてくるが、こうした融合遺伝子は病的検体のみではなく、正常検体にも検出されてくる。それらが病的意義のあるものなのかどうか、量的な比較も行い検討を加えたい。
3.遺伝子再構成による異所性遺伝子発現の解析。これまで解析した遺伝子の他に、CYP1D1P,LCT2,WNT16,ADAM12,PLXDC1など多数の候補遺伝子が抽出されており、これらについて解析をすすめる。この中で、WNT16はヒト内在性レトロウイルスHERV-H18 のLTRがWNT16の5’-UTRに挿入され、異所性遺伝子発現が生じたもので非常に興味深い。
4.TCF4-MAML3融合遺伝子は、固形癌において報告されているが、造血器腫瘍での報告はない。本症例においてWNT関連遺伝子の発現増加を認めており、TCF4-MAML3との関連について研究を進める。結果は本年の日本血液学会にて発表予定である。
5.新規融合遺伝子の機能解析については、その他にもARMC7-BLMH、CMC4-NCOA1など多数の新規融合遺伝子を同定しており、興味深い融合遺伝子についての機能解析を進めていく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次年度使用額が生じた理由
RNA-seq用の遺伝子ライブラリーを作成するキットおよび試料の量と質を検定するリアルタイムPCR用キットは前年度からの残薬を使用するなどしたため、使用額 に差が生じた。また、RNA-seqを実施する予定が遅れ、融合遺伝子の機能解析にも支障が生じたため、次年度への繰越が生じた。
使用計画
RNA-seq解析と融合遺伝子の解析のため、次世代シークエンス用試薬、細胞培養試薬、遺伝子解析用試薬等の購入に充 てる予定である。研究期間延長をしており今年度に計画を遂行したい。
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