新型エンテロトキシン（BEC）産生性ウェルシュ菌による食中毒の発生機序の解明

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K19283
• 研究機関: 大阪府立公衆衛生研究所
• 研究代表者: 余野木 伸哉 大阪府立公衆衛生研究所, 感染症部, 研究員 (20553613)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: BEC / エンテロトキシン / ウェルシュ菌 / ２成分毒素

研究実績の概要

既知のエンテロトキシンCPEと新型エンテロトキシンBECの両成分であるBECaおよびBECb遺伝子を同時に検出するPCR法について論文が受理された（Yonogi S, et al. Journal of Microbiological Methods. 2014, 127, 172-175）。本法は当所ホームページで紹介し（http://www.iph.osaka.jp/food/welchii.html）、地方衛生研究所等へ技術協力やポディティブコントロールの配布などを行っている。
BECの構成成分であるBECaについてBECa単独およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）との複合体の結晶構造を明らかにし、論文が受理された（Kawahara K, et al. Biochem Biophys Res Commun. 2016, 11, 261-267 ）。BECaはウェルシュ菌イオタ毒素などのADPリボシル化２成分毒素のa成分とよく類似した構造をしていることがわかった。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

BECaおよびBECbに対するポリクローナル抗体を作製したが、ELISA法などタンパクを検出する系の構築は未完である。BECbのCaco2細胞に対する細胞毒性について経時的変化の測定が完了していない。

今後の研究の推進方策

Caco2細胞に対するBECbの細胞毒性を経時的に定量化する。オリゴマーの形成や細胞膜レセプターなどBECbの細胞膜上での挙動を解明をする。BECタンパクの検出系を構築し、この系を使用してBEC産生性と芽胞形成との関連性を明らかにする。

次年度使用額が生じた理由

研究の進捗にやや遅れがあるため。

次年度使用額の使用計画

昨年度に構築できなかったBECタンパクの検出系などを構築する。構築したタンパク発現系を用いて、栄養体増殖用培地（TGY培地、GAM培地、TGC培地など）と芽胞形成培地（mDS培地）におけるBECおよびその他タンパクの発現を比較する。
BECbの液体貯留活性の発現機序を明らかにするために、オリゴマーの形成や細胞膜レセプターなど細胞膜上での挙動に迫る。
これらの研究を遂行するために使用する。

研究成果

• [雑誌論文] Development and application of a multiplex PCR assay for detection of the Clostridium perfringens enterotoxin-encoding genes cpe and becAB. (2016)
  • 著者名/発表者名: Yonogi S, Kanki M, Ohnishi T, Shiono M, Iida T, Kumeda Y.
  • 雑誌名: Journal of Microbiological Methods 巻: 127 ページ: 172-175
  • DOI: 10.1016/j.mimet.2016.06.007
  • 査読あり
• [雑誌論文] Crystal structure of the ADP-ribosylating component of BEC, the binary enterotoxin of Clostridium perfringens (2016)
  • 著者名/発表者名: Kawahara K, Yonogi S, Munetomo R, Oki H, Yoshida T, Kumeda K, Matsuda S, Kodama T, Ohkubo T, Iida T, Nakamura S.
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun 巻: 480 ページ: 261-267
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2016.10.042
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [学会発表] ウェルシュ菌エンテロトキシン遺伝子(cpe、becAおよびbecB)を同時に検出するマルチプレックスPCR法の構築と汚染実態調査 (2016)
  • 著者名/発表者名: 余野木伸哉, 神吉政史, 大西貴弘, 塩野将巳, 飯田哲也, 川津健太郎, 久米田裕子
  • 学会等名: 第112回 日本食品衛生学会学術講演会
  • 発表場所: 函館国際ホテル（北海道函館市）
  • 年月日: 2016-10-27
• [学会発表] ウェルシュ菌新型エンテロトキシン(BEC)に関する研究 (2016)
  • 著者名/発表者名: 余野木伸哉, 久米田裕子
  • 学会等名: 平成28年度近畿腸管微生物研究会
  • 発表場所: ホテルグランヴィア大阪（大阪府大阪市）
  • 年月日: 2016-06-11
• [図書] 大阪府立公衆衛生研究所公衛研ニュースNo61 (2017)
  • 著者名/発表者名: 余野木伸哉
  • 総ページ数: 2
  • 出版者: 大阪府立公衆衛生研究所
• [備考] 簡便に使用できるウェルシュ菌エンテロトキシン遺伝子に対するマルチプレックスPCR法
  • URL: http://www.iph.osaka.jp/food/welchii.html
• [備考] 大阪府立公衆衛生研究所 公衛研ニュース No61
  • URL: http://www.iph.pref.osaka.jp/news/vol61/news61.pdf