| 研究概要 |
ヒアルロン酸糖鎖の受容体識別機構を解明するため、表面プラズモン共鳴法による動力学的解析を行った。本実験に用いるアナライトとして、CD44ヒアルロン酸受容体の細胞外領域をイムノグロブリンFc領域に結合した融合タンパク質を用いた。融合タンパク質は、発現ベクターを遺伝子導入した動物細胞の培養上精からプロテインGセファロースアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより単離・精製した。またRHAMMヒアルロン酸受容体はヒアルロン酸結合ドメインであるカルボキシル末端側領域をGST融合タンパク質として大腸菌内で発現後、細胞可溶化画分から定法に従い単離・精製した。更に、ヒアルロン酸結合性細胞外マトリックス分子としてバーシカンを対象に、ヒアルロン酸-受容体相互作用に対する増強効果を検討するため、バーシカンのアミノ末端領域に存在するヒアルロン酸結合ドメインをヒスチジンタグとの融合タンパク質として動物細胞で発現した。バーシカン融合タンパク質は、培養上精からニッケルアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより単離・精製した。一方、ヒアルロン酸標品として糖鎖長の異なる三種類(平均分子量1000kDa,150kDa,6.8kDa)をビオチン化してストレプトアビジンセンサーチップ上に固相化した。これら糖鎖長の異なるヒアルロン酸に対する二種のヒアルロン酸受容体の結合を表面プラズモン共鳴装置により解析した。その結果、何れのヒアルロン酸受容体融合タンパク質も、ヒアルロン酸固相化センサーチップに親和性を示した。この結果を受け、現在、詳細な動力学的解析を行っており、さらに今後バーシカンヒアルロン酸結合ドメイン共存下での結合の変化についても解析する予定である。
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