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手術で治療目的に摘出された副腎から患者の承諾得て副腎髄質を入手した。
ヒト副腎髄質から、内因性麻薬用物質enkephalinの前駆体であるPre-pro-enkephalinのtotal RNAを抽出した。
NCBIに登録された配列情報からPre-pro-enkephalinの完全長を含む塩基配列を増幅するため、5‘側の翻訳開始領域がコザック配列をもつようにプレイマーを設計した。
上記で抽出したtotal RNAからcDNAを合成し、cDNAを鋳型としてPCRを行った。
上記プレイマーを用いで、目的とするPre-pro-enkephalinの遺伝子を増幅した。
増幅した断片をレトロウイルスベクター(pDON-AI-2-Neo骨格とpMEI-5Neo[Not I-BamHI]骨格)に挿入した。感染効率はpDON-AI-2Neo10倍希釈で55.83%、pMEI-5Neoで8.89%であり、pDON-AI-2-Neoを基本骨格としたウイルスベクターを選択し作製した。研究対象はレンチウイルスとレトロウイルスであるが、まずレトロウイルスを用いた研究を先行させた。
挿入したPre-pro-enkephalinの遺伝子の塩基配列を確認した。
組み換えレトロウイルスの産生は、細胞へのトランスフェクション開始から24時間後、上清を回収しフィルターで濾過後ウイルス液としておこなった。
組み換えレトロウイルス産生細胞の作製を行った。
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