哺乳類の生殖腺の性的２型の維持と破綻の分子基盤の解明

2018 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 17H01501
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 金井 克晃 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 准教授 (30260326)
• 研究分担者: 平松 竜司 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 助教 (70555284) ; 平手 良和 東京医科歯科大学, 統合研究機構, 講師 (70342839) ; 九郎丸 正道 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 教授 (00148636)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: 性分化 / セルトリ細胞 / 顆粒膜細胞 / 性転換 / テストステロン / AMH / heterogeneity / マウス

研究実績の概要

雄ヌードマウスへ移植による胎子卵巣の雄性化の過程において、継時的なトランスクリプトーム解析と精巣化の候補遺伝子欠損の移植片での解析の結果、卵巣移植片でのSOX8, AMHの活性は、初期の卵胞の退行・精巣様の構造形成を促進するが、SOX9陽性のセルトリ様細胞の出現（性転換）には必須でないことが判明した。このセルトリ様細胞の出現には、下等脊椎動物のメスからオスへの性転換と類似し、雄ヌードマウスの精巣由来のtestosteroneが中心的な役割を担っていることを証明した。また、卵巣内のセルトリ様細胞の出現部位が、中腎側に境界部領域に局在するSDSI陽性(Sry-dependent SOX9 inducibility) 陽性の顆粒膜細胞（つまり、Sox9ゲノムからの転写がいつでも可能な状態の顆粒膜細胞）の分布と重なる。そこで、この顆粒膜細胞のheterogenityの分子基盤を明確にするため、２年目には single cell RNA seq 解析を行なった。野生型の胎齢13日の胎子卵巣を中腎に沿った側と反対側に2分割し、ICELL8TMシステムと次世代シーケンサーを用いて418個のシングルセル（中腎遠位側で184個、近位側で234個）の遺伝子発現プロファイルを作成した。Seurat packageを用いてクラスタリング、t-SNE解析の結果、FoxL2陽性の顆粒膜細胞はLgr5陽性細胞とは異なる体細胞集団を形成し、Foxl2陽性の顆粒膜細胞に高い発現を示す新たな83遺伝子を同定した。さらに、このFoxl2陽性の細胞集団の中で、クロマチンのリモデリング、エピジェネティック関連因子Hmgb2/Hmgb1, Hdac3の発現量の差異により ２つのサブグループに分けることができ、これが胎子の顆粒膜細胞のheterogeneityを反映している可能性が示唆された。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

AMH-TRECKの精巣の培養系の卵巣への性転換については、分担研究者の職場の移動に伴い研究メンバーの変更を余儀なくされ、予定より解析が遅れる結果となった。一方で、胎子卵巣の雄性化の分子基盤の解析は、様々な追試実験を強いられたが、テストステロン依存性であることが証明することができ、それにより無事に論文が受理される運びとなった。さらに、single cell RNA seq解析により、heterogenityを特徴づけるエピジェネティック関連の遺伝子発現の変動を捉えることに成功した。

今後の研究の推進方策

当初の計画通りに、single cell RNA seqにより得られた候補遺伝子の卵巣内での発現解析を進める予定である。つまり、クロマチンのリモデリング、エピジェネティック関連の候補因子群の whole mount in situ hybridization とFOXL2との二重染色により、候補遺伝子の発現細胞の分布を解析する。また、最終年度は、胎子精巣のDT処理による卵巣化については、新しい分担者が精力的にセルトリ細胞から分泌される新規の卵巣皮質抑制因子の同定を進めていく予定である。

研究成果

• [国際共同研究] University of Utah, School of Medicine(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: University of Utah, School of Medicine
• [国際共同研究] University of Queensland(オーストラリア)
  • 国名: オーストラリア
  • 外国機関名: University of Queensland
• [雑誌論文] Molecular and genetic characterization of partial masculinization in embryonic ovaries grafted into male nude mice. (2019)
  • 著者名/発表者名: Miura K, Harikae K, Nakaguchi M, Imaimatsu K, Hiramatsu R, Tomita A, Hirate Y, Kanai-Azuma M, Kurohmaru M, Ogura A, Kanai Y.
  • 雑誌名: PLoS ONE 巻: 14 ページ: e0212367
  • DOI: doi: 10.1371/journal.pone.0212367.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Nr5a1 suppression during the fetal period optimizes ovarian development by fine-tuning of Notch signaling (2019)
  • 著者名/発表者名: Nomura R, Kashimada K, Suzuki H, Zhao L, Hosokawa-Tsuji A, Yagita H, Takagi M, Kanai Y, Bowles J, Koopman P, Kanai-Azuma M, Morio T.
  • 雑誌名: J Cell Sci 巻: 32 ページ: -
  • DOI: doi: 10.1242/jcs.223768.
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Competition for Mitogens Regulates Spermatogenic Stem Cell Homeostasis in an Open Niche. (2019)
  • 著者名/発表者名: Kitadate Y, Jorg DJ, Tokue M, Maruyama A, Ichikawa R, Tsuchiya S, Segi-Nishida E, Nakagawa T, Uchida A, Kimura-Yoshida C, Mizuno S, Sugiyama F, Azami T, Ema M, Noda C, Kobayashi S, Matsuo I, Kanai Y, Nagasawa T, Sugimoto Y, Takahashi S, Simons BD, Yoshida S.
  • 雑誌名: Cell Stem Cell. 巻: 24 ページ: 79-92
  • DOI: doi: 10.1016/j.stem.2018.11.013.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Sox17 is essential for proper formation of the marginal zone of extraembryonic endoderm adjacent to a developing mouse placental disk. (2018)
  • 著者名/発表者名: Igarashi H, Uemura M, Hiramatsu R, Hiramatsu R, Segami S, Pattarapanawan M, Hirate Y, Yoshimura Y, Hashimoto H, Higashiyama H, Sumitomo H, Kurohmaru M, Saijoh Y, Suemizu H, Kanai-Azuma M, Kanai Y.
  • 雑誌名: Biol Reprod. 巻: 99 ページ: 578-589
  • DOI: doi: 10.1093/biolre/ioy079.
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] CRISPR/Cas9-mediated knock-in of the murine Y chromosomal Sry gene. (2018)
  • 著者名/発表者名: Imaimatsu K, Fujii W, Hiramatsu R, Miura K, Kurohmaru M, Kanai Y.
  • 雑誌名: J Reprod Dev. 巻: 64 ページ: 283-287
  • DOI: doi: 10.1262/jrd.2017-161.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] High-FGF9/low-retinoic acid signaling states in Sertoli valve niche for spermatogenic stem/progenitor cells. (2018)
  • 著者名/発表者名: Yoshiakira Kanai
  • 学会等名: 8th International Symposium on vertebrate sex determination. Kona Hawaii, April 16 - 20, 2018
  • 国際学会
• [学会発表] Amh欠損雄マウスを用いたミューラー管遺残症における遺残子宮の比較病態解析 ワークショップ「脊椎動物の性決定、性分化の分子機構」 (2018)
  • 著者名/発表者名: 平松竜司、村田千晴、三浦健人、平手良和、金井正美、金井克晃
  • 学会等名: 第41回日本分子生物学会年会 パシフィコ横浜 2018年11月29日
• [図書] 「遺伝子から解き明かす「性」の不思議な世界」田中実編 (分担執筆, 第６章 哺乳類の生殖腺の性) (2019)
  • 著者名/発表者名: 金井克晃、平松竜司
  • 総ページ数: 541
  • 出版者: 一色出版
  • ISBN: 978-4-909383-06-8
• [図書] 獣医発生学 第２版 T. A. McGeady 他著 木曾監修 (担当:共訳) (2019)
  • 著者名/発表者名: 金井克晃、金井正美
  • 総ページ数: 434
  • 出版者: 学窓社
  • ISBN: 978-4-87362-763-2
• [図書] Reproductive and Developmental Strategies. Editors: Kobayashi et al. (Eds.) (分担執筆, Chapter 20: Sex determination and differentiation in mammals.) (2018)
  • 著者名/発表者名: Kento Miura, Ayako Tomita, Yoshiakira Kanai
  • 総ページ数: 789
  • 出版者: Springer, Tokyo.
  • ISBN: 978-4-431-56609-0
• [備考] 研究紹介・マウス生殖細胞／生殖腺の発生、性分化および精子発生の分子機構の解明
  • URL: http://www.vm.a.u-tokyo.ac.jp/kaibo/seibunnka.html#miura