DAA治療によるHCV排除後の肝細胞における、可逆的および不可逆的肝障害の解析

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K09447
• 研究機関: 国立感染症研究所
• 研究代表者: 脇田 隆字 国立感染症研究所, 所長, 所長 (40280789)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: ＨＣＶ

研究実績の概要

ＨＣＶの治療効果はDAAにより飛躍的に高まった。ＨＣＶ排除の目的は慢性肝疾患と全身状態の改善と、肝発がん予防である。しかし、ＨＣＶの長期間にわたる持続感染による肝炎による細胞障害、組織障害の分子機構と治療によるその可逆性についてはよくわかっていない。本研究ではＨＣＶ感染モデルを用いて、ＨＣＶ感染肝障害の微細構造変化および遺伝子発現変化を解析し、DAA治療によるウイルス排除後の肝障害改善に資する基盤的研究を実施する。ウイルス培養系において、未感染細胞、感染細胞、排除後細胞を区別できる実験系を構築するためにスイッチング発現系を利用する。平成29年度にはRFP遺伝子の下流にGFP遺伝子を配置したレポーターカセット遺伝子をHuh751細胞に導入して選択培養とソーティングにより、約50％の細胞がRFP陽性となるHuh751-RG細胞株を樹立した。さらにCreを発現する組み換えHCV(HCV-Cre)を構築した。HCV-CreをHuh751-RG細胞に感染することにより遺伝子組み換えがおこり、GFP発現細胞を確認できた。今年度はHuh751-RG細胞をさらに単クローン化した。単クローン細胞ではすべての細胞でRFPを発現した。この単クローン細胞にHCV-Creを感染させると、様々な割合でGFP発現細胞が観察された。そこから、感染細胞あるいは非感染細胞に分離して培養を継続することにより、GFP発現細胞のみでHCV感染が確認され、RFP発現細胞では極めて低いHCV感染が確認できた。さらに、HCV感染した細胞を抗ウイルス薬で処理してHCVを排除した。薬物処理停止後2週間以上経過してもHCVは検出されなかった。以上の実験により、HCV未感染細胞、HCV感染細胞、HCV感染後排除細胞を樹立できた。次年度はこれらの細胞のオルガネラ変化、遺伝子およびタンパク発現変化について解析を進める。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

昨年度作成した細胞をさらに改良でき、未感染、感染、感染後の細胞を作成できた。来年度はこの細胞系の解析を進める

今後の研究の推進方策

まず、HCV感染による肝細胞の微細構造変化を解析する。これまで、HCVキャリア患者の肝組織像を解析すると微細構造変化を観察したので、培養細胞で同様の現象を解析する．また、感染細胞をDAAで治療することによりウイルスを排除する。このウイルス排除細胞での細胞内微細構造変化の持続あるいは消失について検討する．これは臨床におけるSVR後の肝障害の持続やHCCの発症の基礎検討につながる。また、微細構造変化だけでなく、遺伝子発現プロファイルについても解析を実施する。

次年度使用額が生じた理由

今年度は細胞のクローニング作業のため、遺伝子発現解析までいたらなかった。細胞は今年度完成したので来年度遺伝子発現などの解析作業に研究費を使用する予定

研究成果

• [雑誌論文] Inhibition Mechanisms of Hepatitis C Virus Infection by Caffeic Acid and Tannic Acid (2019)
  • 著者名/発表者名: Shirasago Yoshitaka、Inamori Yoko、Suzuki Takeru、Tanida Isei、Suzuki Tetsuro、Sugiyama Kazuo、Wakita Takaji、Hanada Kentaro、Fukasawa Masayoshi
  • 雑誌名: Biological and Pharmaceutical Bulletin 巻: 42 ページ: 770～777
  • DOI: 10.1248/bpb.b18-00970
  • 査読あり
• [雑誌論文] The aryl hydrocarbon receptor?cytochrome P450 1A1 pathway controls lipid accumulation and enhances the permissiveness for hepatitis C virus assembly (2018)
  • 著者名/発表者名: Ohashi Hirofumi、Nishioka Kazane、Nakajima Syo、Kim Sulyi、Suzuki Ryosuke、Aizaki Hideki、Fukasawa Masayoshi、Kamisuki Shinji、Sugawara Fumio、Ohtani Naoko、Muramatsu Masamichi、Wakita Takaji、Watashi Koichi
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 巻: 293 ページ: 19559～19571
  • DOI: 10.1074/jbc.RA118.005033
  • 査読あり
• [雑誌論文] Thermostable hepatitis C virus JFH1-derived variant isolated by adaptation to Huh7.5.1 cells (2018)
  • 著者名/発表者名: Shirasago Yoshitaka、Fukazawa Hidesuke、Aizaki Hideki、Suzuki Tetsuro、Suzuki Takeru、Sugiyama Kazuo、Wakita Takaji、Hanada Kentaro、Abe Ryo、Fukasawa Masayoshi
  • 雑誌名: Journal of General Virology 巻: 99 ページ: 1407～1417
  • DOI: 10.1099/jgv.0.001117
  • 査読あり
• [雑誌論文] Evaluation of in vitro screening and diagnostic kits for hepatitis C virus infection (2018)
  • 著者名/発表者名: Momose Haruka、Matsuoka Sahoko、Murayama Asako、Yamada Norie、Okuma Kazu、Ikebe Emi、Hoshi Yuji、Muramatsu Masamichi、Wakita Takaji、Toyota Kuro、Kato Takanobu、Hamaguchi Isao
  • 雑誌名: Journal of Clinical Virology 巻: 105 ページ: 97～102
  • DOI: 10.1016/j.jcv.2018.06.008
  • 査読あり
• [雑誌論文] Expression of a functional intrabody against hepatitis C virus core protein in Escherichia coli and silkworm pupae (2018)
  • 著者名/発表者名: Kato Tatsuya、Hasegawa Moeko、Yamamoto Takeshi、Miyazaki Takatsugu、Suzuki Ryosuke、Wakita Takaji、Suzuki Tetsuro、Park Enoch Y.
  • 雑誌名: Protein Expression and Purification 巻: 150 ページ: 61～66
  • DOI: 10.1016/j.pep.2018.05.009
  • 査読あり
• [学会発表] C型慢性肝炎のウイルス学的著効後の肝組織のウイルス遺伝子 (2018)
  • 著者名/発表者名: 相崎英樹、脇田隆字
  • 学会等名: 第54回日本肝臓学会総会
• [学会発表] 感染性を有する4型C型肝炎ウイルスの樹立 (2018)
  • 著者名/発表者名: 渡邉則幸、鈴木貴也、伊達朋子、スス・ムェー、Hussein H Aly、相崎英樹、村松正道、 脇田隆字
  • 学会等名: 第28回抗ウイルス療法学会学術集会
• [学会発表] Hepatitis C virus infection triggers the transactivation of aryl hydrocarbon receptor to rearrange hepatic lipid biosynthesis (2018)
  • 著者名/発表者名: Hirofumi Ohashi, Syo Nakajima, Sulyi Kim, Ryosuke Suzuki, Hideki Aizaki, Masayoshi Fukasawa, Shinji Kamisuki, Fumio Sugawara, Naoko Ohtani, Masamichi Muramatsu, Takaji Wakita, Koichi Watashi
  • 学会等名: 第66回日本ウイルス学会学術集会
• [学会発表] Abnormal hepatocellular organelles remain to be observed in sustained virological response (SVR) patients (2018)
  • 著者名/発表者名: Haruyo Aoyagi, Hiroko Iijima, Xin Zheng, Yu Ting Kao, Gewaid E. Hossam, Mami Matsuda, Koichi Watashi, Ryosuke Suzuki, Takahiro Masaki, Noritomo Shimada, Keizo Kato, Akihito Tsubota, Ayako Mimata, Yuriko Sakamaki, Shizuko Ichinose, Kenjiro Wake, Takaji Wakita, Hideki Aizaki.
  • 学会等名: 第66回日本ウイルス学会学術集会
• [学会発表] Identification of aryl hydrocarbon receptor ligands inhibiting the lipid accumulation and hepatitis C virus production (2018)
  • 著者名/発表者名: Kazane NISHIOKA , Hirofumi OHASHI, Ryosuke SUZUKI, Hideki AIZAKI, Masamichi MURAMATSU, Takaji WAKITA, Koichi WATASHI
  • 学会等名: 第66回日本ウイルス学会学術集会
• [学会発表] Construction of chimeric reporter HCV with efficient production capacity (2018)
  • 著者名/発表者名: Rika Sato, Noriyuki Watanabe, Hussein H Aly, Madoka Koyanagi, Yutaka Arimura, Hideki Aizaki, Masamichi Muramatsu, Takaji Wakita
  • 学会等名: 第66回日本ウイルス学会学術集会
• [学会発表] 感染性を有する4型C型肝炎ウイルスの樹立 (2018)
  • 著者名/発表者名: 渡邉則幸、鈴木貴也、伊達朋子、スス・ムェー、Hussein H Aly、相崎英樹、村松正道、脇田隆字
  • 学会等名: 第66回日本ウイルス学会学術集会
• [学会発表] SVR後の肝組織のウイルス遺伝子およびオルガネラ異常の残存 (2018)
  • 著者名/発表者名: 相崎英樹、村松正道、脇田隆字
  • 学会等名: 第42回日本肝臓学会東部会
• [学会発表] Antiviral activity of phospholipase A2 group V (PLA2G5) against HCV (2018)
  • 著者名/発表者名: Francesc PUIG-BASAGOITI, Masayoshi FUKASAWA, Ryosuke SUZUKI, Koichi WATASHI, Masamichi MURAMATSU, Takaji WAKITA, Hideki AIZAKI
  • 学会等名: 25th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses
  • 国際学会
• [学会発表] Aryl hydrocarbon receptor-cytochrome p450 1a1 pathway regulates hepatic lipid biosynthesis to maximize hepatitis C virus production (2018)
  • 著者名/発表者名: Hirofumi Ohashi, Syo Nakajima, Sulyi Kim, Ryosuke Suzuki, Hideki Aizaki, Masayoshi Fukasawa, Shinji Kamisuki, Kouji Kuramochi, Fumio Sugawara, Naoko Ohtani, Masamichi Muramatsu, Takaji Wakita, Koichi Watashi
  • 学会等名: 25th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses
  • 国際学会
• [学会発表] Aryl hydrocarbon receptor ligands inhibiting the lipid accumulation and hepatitis C virus production (2018)
  • 著者名/発表者名: Kazane Nishioka, Hirofumi Ohashi, Ryosuke Suzuki, Hideki Aizaki, Kouji Kuramochi, Masamichi Muramatsu, Takaji Wakita, Koichi Watashi,
  • 学会等名: 25th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses
  • 国際学会
• [学会発表] Flavivirus subviral particles-based DNA vaccine induces neutralizing antibodies against HCV (2018)
  • 著者名/発表者名: Keigo Yato, Mami Matsuda, Noriyuki Watanabe, Shogo Nakajima, Akira Fujimoto, Koichi Watashi, Hideki Aizaki, Takanobu Kato, Koji Tamura, Masamichi Muramatsu, Takaji Wakita, Ryosuke Suzuki
  • 学会等名: 25th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses
  • 国際学会
• [学会発表] Construction of chimeric reporter HCV with efficient production capacity (2018)
  • 著者名/発表者名: Rika Sato, Noriyuki Watanabe, Hussein H Aly, Madoka Koyanagi, Yutaka Arimura, Hideki Aizaki, Masamichi Muramatsu, Takaji Wakita
  • 学会等名: 25th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses
• [学会発表] Establishment of infectious genotype 4a HCVcc (2018)
  • 著者名/発表者名: Noriyuki Watanabe, Takaya Suzuki, Tomoko Date, Su Su Hmwe, Hussein H Aly, Hideki Aizaki, Masaya Sugiyama, Masashi Mizokami, Mohamed El Kassas, Ashraf Tabl, William IV Delaney, Guofeng Cheng, Masamichi Muramatsu, Takaji Wakita
  • 学会等名: 25th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses
  • 国際学会