| 研究課題/領域番号 |
17K10526
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| 研究機関 | 日本医科大学 |
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研究代表者 |
松谷 毅 日本医科大学, 医学部, 准教授 (50366712)
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| 研究分担者 |
萩原 信敏 日本医科大学, 医学部, 講師 (00328824)
松田 明久 日本医科大学, 医学部, 助教 (00366741)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | ミトコンドリア / 小胞体ストレス / アポトーシス / PPAR-γ－アゴニスト |
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| 研究実績の概要 |
外科的侵襲によってマクロファージが浸潤した腹腔内脂肪組織にアポトーシス細胞を認め，その機序としてミトコンドリアによる酸化ストレスや小胞体ストレスが関与していることを明らかにする．さらにPPAR-γ－アゴニストを用いて脂肪細胞の核内受容体を活性化することにより，外科的侵襲時の脂肪細胞・マクロファージ機能の変化による小胞体・酸化ストレス誘導性アポトーシスへの影響を解明する．具体的には，①マウス腹膜炎モデルから採取した腹腔内脂肪組織から脂肪細胞と間質細胞を分離し，外科的侵襲によって各細胞における酸化および小胞体ストレス誘導性アポトーシスが起きるかを検討する．②PPAR-γ－アゴニスト投与が，小胞体とミトコンドリア機能を変化させアポトーシス経路へ影響するかを検討する．
マウスCecum ligation and puncture（CLP）モデルを用いて腹腔内脂肪組織を採取し，浸潤したマクロファージを含む間質細胞と成熟脂肪細胞を単離する．各細胞を用いて小胞体ストレス誘導性アポトーシス関連転写因子C/EBP-homologous protein（CHOP）と小胞体分子シャペロンGRP78（BiP）の誘導をRT-PCR法と免疫組織化学染色法で検討する．脂肪細胞と間質細胞が接触することによってアポトーシスが誘導するのか，間質細胞と脂肪細胞が産生する液性因子によって互いに活性化されてアポトーシスが誘導されるのか，in vitroで検討する．さらにアポトーシスに伴いミトコンドリアではCaspase活性物質であるシトクロムCなどが放出し，電子伝達系の変化から膜電位差が消失するので，親油性・陽イオンの蛍光色素を使用して定性・定量的に解析する．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
培養脂肪細胞において，ERストレス惹起因子として小胞体Ca2+-ATPase阻害薬であるタプシガルギンを用いた．分化させた脂肪細胞(SW872)とマクロファージ様細胞株(分化U937)を共培養後，タプシガルギンとラパマイシンを処置し，定量的RT-PCR法にて解析した．IL-6発現量はタプシガルギンで上昇し，ラパマイシンで抑制された．ウエスタンブロットでの解析では，タプシガルギン処置はCHOPタンパク質量を増加させ，ラパマイシン処置により抑制された．内臓脂肪型肥満マウス(TSOD)とその対照動物(TSNO)におけるCLP後の生存率を比較した．TSODはCLP後2日目にて全例が死亡したのに対し，TSNOは一週間以上生存した．TSODは術後ラパマイシン(1 mg/kg, i.p.)を投与したが，生存率の改善効果は観察されなかった．ERストレス応答因子の発現レベルは，TSNOよりTSODで高かった．GRP78/Bipの発現はCLPにより低下し，ラパマイシンで回復したがCHOP量に変化はなかった．CLP後に脂肪組織中でTUNEL陽性のアポトーシス細胞が出現したが，ラパマイシン投与により減少する傾向がみられた．
小胞体ストレス誘導性アポトーシスの実験系は順調だが，ミトコンドリア誘導性アポトーシスの実験系およびPPAR-γ－アゴニスト投与の実験系は有意な結果が出ていないため，遅れている．
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| 今後の研究の推進方策 |
内臓脂肪型肥満マウス(TSOD)とその対照動物(TSNO)に，吸入麻酔後CLP群を作成し犠死させる．PPAR-γアゴニストをCLP施行前に7日間投与した群を作成し，腹腔内脂肪細胞と間質細胞を抽出し，マクロファージ様細胞株(分化U937)および分化させた脂肪細胞(SW872)と腹腔内脂肪組織から単離した間質細胞との共培養法でもアポトーシスが誘導するのか，接触法と非接触法で検討する．各細胞を用いて小胞体ストレス誘導性アポトーシス関連転写因子C/EBP-homologous protein（CHOP）と小胞体分子シャペロンGRP78（BiP）の誘導をRT-PCR法と免疫組織化学染色法で検討する．同時にミトコンドリア誘導性アポトーシスとして，Mitochodria Isolation Kitを用いてミトコンドリアを単離し，親油性・陽イオンの蛍光色素JC-1を使用してミトコンドリア膜電位差の検出を行う．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当該研究における動物およびin vitroの実験，ミトコンドリア・小胞体ストレス誘導性アポトーシスの解析・データ収集等は順調に進行しているが，論文作成が完結していないため．
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