|
光合成における水分解系の最小単位は、光化学系II(PSII)の反応中心を形成するD1/D2ヘテロダイマーである。この研究では好熱性シアノバクテリアThermosynechococcus vulcanusのD1/D2タンパク質の遺伝子を中温性シアノバクテリアSynechococcus elongatus PCC 7942中で発現させ、熱安定なD1/D2ヘテロダイマーを精製することを目的とした。S. elongatus PCC 7942株の染色体上のD1およびD2タンパク質の遺伝子ORFをT. vulcanus由来の各ORFで置換するために、薬剤耐性遺伝子の数に制約されないrpsl2媒介遺伝子置換法を開発した。PSII複合体の精製を容易に行うため、psbB遺伝子にコードされる内部アンテナタンパク質CP47のC末端にヒスチジンタグ(histag)を付加したpsbB変異株を作成した。この株の解析の結果、psbB遺伝子に関してヘテロ型となっていたので、psbB遺伝子のオペロン下流に存在するpsbT遺伝子の5'上流に転写プロモーターを追加した変異株も作成した。また、相同組換え頻度を向上させるため、psbB-psbT遺伝子領域の長いDNAをクローン化したプラスミドを作成した。変異株の培養菌体の可溶化チラコイド膜より、Ni-アフィニティークロマトグラフィーによって、histagの付加されたPSII複合体の精製を行った結果、D1/D2ヘテロダイマーを含む複合体が得られた。
|
