| 研究概要 |
まず脂肪細胞に特異的な発現遺伝子であるPPARG2のcDNAとEGFPの融合遺伝子を作製した。大腸菌へPPARG2遺伝子の導入されたプラスミドを導入し、LB培地で培養後、プラスミドDNAを大量調整した。得られたプラスミドを鋳型とし、プライマーを用いてPPARG2遺伝子を増幅した。得られたPPARG2のPCR生成物を切り出し、TAクローニングを行った。次に、PPARG2遺伝子をベクターを用いてGFPとfusionさせた。ベクターから制限酵素を用いてPPARG2遺伝子を切り出し、GFPの導入されたベクターに挿入し、PPARG2-GFPの融合遺伝子を作製した。次に、この融合遺伝子を細胞にトランスフェクションし、融合遺伝子の発現解析を行った。導入した細胞では、GFPとPPARG2が共に発現していることを蛍光顕微鏡で確認した。さらに、PPARG2-GFPの融合遺伝子を導入した細胞で、RT-PCRを行ったところ、PPARG2,GFP,PPARG+GFPそれぞれの発現が認められた。よって、融合遺伝子が作製された。現在、この融合遺伝子を発現するベクターの構築を行っており、各種細胞での発現を確認中である。ベクターの構築では、PPARG2プロモーターをクローニングし、ベクターへ導入した。ベクターへの導入を確認した後に、Lipofectaminを用いて脂肪細胞に遺伝子を導入、現在、GFPの発現およびPPARG2の発現を確認している段階である。
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