| 研究課題/領域番号 |
18H02323
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| 研究機関 | 岩手大学 |
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研究代表者 |
喜多 一美 岩手大学, 農学部, 教授 (20221913)
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| 研究分担者 |
村岡 宏樹 岩手大学, 理工学部, 助教 (50546934)
牧野 良輔 愛媛大学, 農学研究科, 助教 (80772821)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | アマドリ化合物 / アミノ酸 / 筋管細胞 / タンパク質合成 / グルコース取り込み / GLUT12 |
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| 研究実績の概要 |
平成30年度では、以下の2点について検討した。
１）ニワトリ胚由来筋管細胞のアミノ酸トランスポーターを介したアミノ酸吸収およびタンパク質合成におけるアミノ酸アマドリ化合物による競合阻害
単冠白色レグホンの孵卵14日胚から浅胸筋を摘出し、筋管細胞を調製した。培地にフェニルアラニン（Phe）、トリプトファン（Trp）またはバリン（Val）のアマドリ化合物を1000μMとなるように添加し、さらにアミノ酸アマドリ化合物の基質となる3H標識アミノ酸を添加して一晩培養した。タンパク質結合アミノ酸の放射能をタンパク質合成の指標とし、遊離アミノ酸の放射能とタンパク質結合アミノ酸の放射能の和を細胞へのアミノ酸取り込みの指標とした。3H-Phe又は3H-Valを培養液に添加した場合、細胞中へのPhe又はValの取り込みおよびタンパク質合成は、コントロール区と比較して有意に低下した。この結果より、一部のアミノ酸のアマドリ化合物は、アマドリ化合物の基質となるアミノ酸の取り込みを阻害することでタンパク質合成を低下させている可能性が示唆された。
２）ニワトリ胚由来筋管細胞のグルコーストランスポーターを介したグルコース取り込みにおけるアミノ酸アマドリ化合物による競合阻害
筋管細胞を調製し、培地にタンパクを構成する20種類のアミノ酸のアマドリ化合物を1000μMとなるように添加した。筋肉細胞への3H標識した2-デオキシグルコースの取り込み量をグルコース取り込みの指標とした。アラニンおよびシステイン以外のタンパク質を構成する18種類のアミノ酸のアマドリ化合物を添加した全ての区において、コントロール区と比較してグルコースの取り込みが有意に減少した。この結果から、タンパク質を構成するアミノ酸の内、アラニン、システイン以外のアミノ酸のアマドリ化合物は、筋肉細胞へのグルコースの取り込みを抑制することが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ニワトリは高血糖動物であり、血糖値はヒトの正常血糖値の2-3倍を示す。生体内のグルコースは、アミノ酸と非酵素的に結合し、アミノ酸アマドリ化合物を生成する。ここで申請者は、アミノ酸アマドリ化合物の一部が、ニワトリ筋管細胞のタンパク質合成に影響を及ぼすことを見出した。そこで本研究では、アミノ酸アマドリ化合物が筋管細胞のタンパク質合成を制御する機構（アミノ酸およびグルコーストランスポーターとの関係、アミノ酸アマドリ化合物レセプターの探索、アミノ酸アマドリ化合物による細胞内シグナル伝達刺激の有無、アミノ酸アマドリ化合物によるニワトリのin vivo筋肉タンパク質合成制御の可能性）を解明することを目的とした。
平成30年度では、「１）ニワトリ胚由来筋管細胞のアミノ酸トランスポーターを介したアミノ酸取り込みおよびタンパク質合成におけるアミノ酸アマドリ化合物による競合阻害」および「２）ニワトリ胚由来筋管細胞のグルコーストランスポーターを介したグルコース取り込みにおけるアミノ酸アマドリ化合物による競合阻害」について研究を進めた。実験は計画された手順に従って予定どおり遂行された。その結果、「一部のアミノ酸のアマドリ化合物は、アマドリ化合物の基質となるアミノ酸の取り込みを阻害することでタンパク質合成を低下させていること」、「タンパク質を構成するアミノ酸の内、アラニン、システイン以外のアミノ酸のアマドリ化合物は、筋肉細胞へのグルコースの取り込みを抑制することでタンパク質合成を抑制していること」が明らかとなった。
以上より、研究は当初の予定どおり遂行され、期待された結果が得られたことから、「研究は概ね順調に進展している」と判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成31年度では以下の3点について研究を進める予定である。
＜３）各種トランスポーターによるアミノ酸アマドリ化合物の細胞通過の有無＞ 単冠白色レグホンの孵卵14日胚から浅胸筋を摘出し、筋管細胞を調製する。3H標識アミノ酸または3H標識グルコースを用いて放射性アミノ酸アマドリ化合物を合成し、培地に添加する。一定期間培養後、培地を除去し、細胞を洗浄する。細胞をNaOH/Triton-X溶液で溶解し、液体シンチレーションカウンターを用いて放射能を測定する。放射能が検出されれば、アミノ酸アマドリ化合物が細胞内へ取り込まれたか、細胞表面上に結合していたことが示されたことになる。
＜４）細胞内におけるアミノ酸アマドリ化合物のアミノ酸とグルコースにへの分解＞ 単冠白色レグホンの孵卵14日胚から浅胸筋を摘出し、筋管細胞を調製する。安定同位元素（13C）標識グルコースを用いて合成したアミノ酸アマドリ化合物を培地に添加する。一定期間培養後、培地を除去し、細胞を洗浄する。細胞を回収し、脱脂、除蛋白を行う。細胞内に、安定同位元素（13C）標識グルコースが存在しているか否かを、高速液体クロマトグラフ質量分析計（LC-MS）を用いて測定する。13C標識グルコースが検出されれば、筋管細胞内においてアミノ酸アマドリ化合物がアミノ酸とグルコースへ分解したことが示されたことになる。
＜５）アミノ酸アマドリ化合物レセプターの存在＞ 単冠白色レグホンの孵卵14日胚から浅胸筋を摘出し、筋管細胞を調製する。筋管細胞の膜タンパク質を調製し、SDS-PAGEでタンパク質を分離する。分離したタンパク質はPVDF膜に転写し、放射性同位元素で標識したアミノ酸アマドリ化合物を用いたウエスタンリガンドブロットを行い、レセプターの検出を試みる
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