| 研究実績の概要 |
申請者は、PTH高頻度投与マウスにおいて、高カルシウム・低リン状態を確認したうえで、石灰化度をカルセイン標識で検索したところ、コントロールマウスに比べてPTH投与マウスでは石灰化亢進を観察している。そこで、石灰化基質の構成要素であるリン酸イオンの生成・供与に関する膜輸送体・酵素群に属する組織非特異型アルカリホスファターゼ(TNAP)、ピロリン酸合成酵素(ENPP1)、ankylosis(ANK:ピロリン酸輸送機能を有する)、PHOSPHO1（基質小胞内でのリン酸イオン生成）を免疫染色ならびにreal time PCRにて検索したところ、PTH投与でこれらの因子の発現・局在が全て上昇していた。従って、骨芽細胞による一次石灰化の過程においてはPTHによりこれらの因子の発現・機能が亢進すると推察された。そればかりでなく、骨細胞による基質石灰化の成熟、すなわち、Mepe, DMP-1, osteopontinといったSIBLING familyの遺伝子発現が有意に上昇し、それを分解するcathepsin Bの発現低下、ならびに、PHEX発現の上昇が認められた。このことは、骨細胞ネットワークによる基質石灰化の成熟化を示唆しており、PTHで多量に形成された骨基質蛋白が存在したとしても、それらの石灰化を亢進する機序が備わっていることが明らかとなった。一方、その逆の状態、すなわちPTH上昇を誘導せず低リン血症を示すsodium/phosphate cotransporter type IIa/type IIc遺伝子欠損マウスの骨組織では、基質石灰化が著しく低下していた。この原因として、単に血中リン酸濃度の低下だけに依るのか、リン酸イオンの生成・供与に関する膜輸送体・酵素群の機能低下によるのか、現在、最終年度の課題として解析中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
申請者は、PTHの投与頻度を調節することで、高カルシウム・低リン血症を示しながら骨基質合成および石灰化亢進状態を誘導する研究を重ねて実施しており、サンプル作成による誤差は低いと思われる。また、PTH投与による骨基質蛋白合成と石灰化亢進は知られた事実であるが、リン酸カルシウム結晶、すなわち、骨基質石灰化を調整する因子群の発現や局在についてはほとんど報告が無く、今回の検索で、リン酸イオンの生成・供与に関する膜輸送体・酵素群の発現亢進、ならびに、機能亢進の可能性が示唆された。それだけでなく、Mepe, DMP-1, osteopontinといったSIBLING familyの遺伝子発現が有意に上昇し、それを分解するcathepsin Bの発現低下、ならびに、PHEX発現の上昇が認められたことは、骨芽細胞が一次骨化で形成した骨基質を、骨細胞ネットワークがさらに石灰化を成熟（高度化）する可能性が示唆された。この結果は、骨細胞ネットワークの骨基質石灰化に対する新しい作用に繋がり、骨細胞による基質石灰化を含めた「骨質維持」が想定される。一方で、sodium(Na)/phosphate(Pi) cotransporter type IIa/type IIc遺伝子欠損マウス、ならびに、NaPi co-transporter type IIa遺伝子欠損マウス（齧歯類では腎臓におけるリン再吸収が抑制）では、骨基質石灰化が著しく抑制されているが、単に血中リン濃度を反映しているだけなのか、それとも、それだけでなく、リン酸イオンの生成・供与に関する膜輸送体・酵素群、および、骨細胞ネットワークにおけるSIBLING family/PHEX系も骨基質石灰化の成熟化が抑制されているのかなど、当初の計画に沿って研究が進められており、興味ある内容となっている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の研究内容として、NaPi co-transporter type IIa遺伝子欠損マウス（NaPi IIa-/-マウス）、および、NaPi co-transporter type IIa/IIc遺伝子欠損マウス（NaPi IIa-/-/IIc-/-マウス）の骨組織におけるTNAP, ENPP1, PHOSPHO1, ANKの発現 ・局在を検索するとともに、これらNaPi IIa-/-マウスおよびNaPi IIa-/-/IIc-/-マウスの骨基質石灰化も解析する予定である。特に、骨細胞ネットワークにおけるSIBLING family/PHEX系を介した骨基質石灰化の成熟化に寄与するか否かについて、既に本年度の初めから実験を開始している。さらに、追加実験として、これまでと異なる状況、すなわち、腎臓5/6摘出したラット（マウスでは負荷が強いためラットを用いる）に高リン食給餌ならびにカルシミメティクスを投与することで、血中カルシウム濃度が著しく上昇せず、リン濃度上昇およびPTH濃度上昇を誘導したラットを作成し、骨組織の組織化学解析、基質石灰化およびTNAP, ENPP1, PHOSPHO1, ANKならびに、SIBLING family/PHEX系を介した骨基質石灰化の成熟化について検索を進める予定である。
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