| 研究課題/領域番号 |
18K07124
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| 研究機関 | 日本歯科大学 |
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研究代表者 |
田代 有美子 (浦野有美子) 日本歯科大学, 生命歯学部, 講師 (30434145)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 口腔レンサ球菌 / 感染性心内膜炎 / 免疫回避 |
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| 研究実績の概要 |
口腔レンサ球菌であるStreptococcus gordoniiは傷ついた心内膜に感染し、疣贅を作る感染性心内膜炎を引き起こすことが知られている。本疾患の発症には細菌が心内膜に付着するだけでなく、血中に入った細菌が免疫細胞(好中球や単球など)による殺菌を受けずに生存していることが必須になる。S. gordoniiが免疫細胞による殺菌を回避することは報告されているが、殺菌回避に関与する遺伝子の報告はこれまでにない。そこで本研究では、S. gordonii で免疫細胞による殺菌を回避するために働く遺伝子を探索し、その機能解析を行なう。その為、平成３０年度は殺菌回避に関与する遺伝子を同定する目的で下記の研究を実施した。
①S. gordoniiが好中球による殺菌を回避する際、どのような殺菌作用に抵抗性があるかを検討した。検査した殺菌物質は過酸化水素(H2O2)、酸(pH3.0)、リゾチーム、ディフェンシン、ラクトフェリンである。
②好中球による殺菌の回避に働く遺伝子の探索を行った。当初Signature-tagged mutagenesis法を行う予定だったが、計画通りに進まなかった為マイクロアレイ法に変更して研究を進めることとした。具体的には好中球に感染させる前のS. gordonii DL1と感染させた後のDL1との間で発現が変化している遺伝子をマイクロアレイにより探索する。その為、まず初めに好中球がDL1を貪食する過程を経時的に観察し、サンプル回収に適している処理時間を検討した。次に、マイクロアレイに用いるRNAを調整する為に好中球に貪食されたDL1からRNAを効率よく回収する実験方法の確立を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
好中球内に存在する細菌からRNAを効率よく抽出する実験方法の確立が予定よりも遅れてしまい、マイクロアレイが行えていない。確立出来次第早急にマイクロアレイを行う予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成30年度の研究結果をもとに、令和元年度は以下の研究を行う予定である。
①遺伝子欠損変異株を作製し、殺菌回避能が消失するかを検討
マイクロアレイによって得られた情報を元に、目的遺伝子の単離、発現ベクターの作製を行い、S. gordonii DL1の目的遺伝子欠損変異株を作製する。作製した遺伝子欠損変異株を好中球に貪食させ、貪食後の生存率に変化があるかを調べる。
②S. gordoniiの別の菌株や他のレンサ球菌での目的遺伝子の発現の確認
当講座ではDL1株以外にS. gordoniiの標準株８株、臨床分離株２株を所有している。さらに、Streptococcus sanguinis、Streptococcus oralis、Streptococcus mutansなど他の口腔レンサ球菌も保有している。そこで、目的遺伝子がこれらの菌株にも存在するかをサザンブロット法により解析する。これらの菌株の好中球による殺菌に対する抵抗性はすでに明らかとなっている。そこで、本実験で得られる結果と、殺菌に対する抵抗性とを照らし合わせることで目的遺伝子が好中球による殺菌の回避に関与しているかを明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
好中球内に存在する細菌からRNAを効率よく抽出する実験方法の確立が予定よりも遅れてしまい、年度内にマイクロアレイが行えなかった。確立出来次第早急にマイクロアレイを行う予定である。
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