白血病に対するネオアンチゲン特異的な革新的遺伝子改変ヘルパーT細胞療法の開発

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 18K08361
• 研究機関: 三重大学
• 研究代表者: 藤原 弘 三重大学, 医学系研究科, 特任准教授(研究担当) (20398291)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: ネオアンチゲン / 遺伝子改変T細胞 / 急性骨髄性白血病 / 白血病幹細胞 / 細胞免疫療法

研究実績の概要

急速な高齢化社会の進展が助長する急性骨髄性白血病・骨髄異形成症候群治療に於けるアンメットニーズに対して、同種造血幹細胞移植（allo-HSCT）の主体的抗白血病効作用である移植片対白血病効果（GvL）と同様の臨床効果を得る事を目的として、我々は、同疾患に対してHLA-A24拘束性白血病抗原WT1特異的T細胞受容体（TCR）遺伝子導入T細胞（WT1-siTCR-T細胞）を用いて臨床試験（UMIN 0001159）を実施したが、その臨床効果は限定的であった。（Tawara I et al. Blood, 2017）
そこで我々は、臨床効果の改善を目指して、白血病幹細胞を標的として正常組織に対するOn-target/off-tumor有害事象の無いエフェクター細胞である、白血病発症遺伝子変異（driver 変異）がコードする新規変異抗原（パブリックネオアンチゲン）を認識する治療用エフェクター細胞の開発に着手した。
本年度は、本研究遂行上基盤となるネオアンチゲンの同定とそれを認識するread-out T細胞の作製へ向けた技術開発を進めている。加えて、read-out T細胞から治療用T細胞の作製に向けて、WT1-TCR-T細胞療法臨床試験が明らかにした、輸注エフェクター細胞の長期間生着（persistence）を達成する手段として、新たな構造のキメラ型抗原受容体（CAR）遺伝子導入T細胞（CAR-T細胞）の作製に成功した。（業績5）さらに、read-out T細胞の感度を高めることに繋がるTCR分子自体の抗原親和性を人為的に高める新たな方法論を開発して報告した。（業績3）。また、治療用エフェクター細胞の汎用性拡大を目的に、健常者ドナーγ/δ-T細胞の利用法開発を進めている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

我々は、driver変異由来のネオアンチゲンモデルとして、成人T細胞白血病（ATL）の発症原因であるHTLV-1ウイルス遺伝子がコードするTaxタンパクに対するread-out T細胞の作製を試みた。長期寛解中の複数のATL患者末梢血からHLA-A*02:01/Tax178-186及びHLA-A:24:02/Tax301-309テトラマー陽性T細胞をソートし、TCRα/β遺伝子レパトア解析とそれら遺伝子を導入したread-out T細胞の機能を評価した。合わせて、がん抗原特異的遺伝子改変免疫細胞療法の臨床的な汎用性拡大を目指して、TCRα/β遺伝子を導入したアロγ/δ-T細胞の有用性をin vitro及びATL細胞株を移植した免疫不全マウスを用いた治療実験によりin vivo評価を行った（学会発表予定）。並行して、当教室の他グループと共同して大腸がん患者を対象に腫瘍浸潤T細胞（TIL）のTCRα/β遺伝子を導入したread-out T細胞の作製、患者大腸がん細胞に対する反応性の検討、NSGによる患者大腸がん細胞の遺伝子変異情報を用いたネオアンチゲン候補の抽出とread out T細胞を用いた抗原提示細胞上に発現させた候補ネオアンチゲンの評価、これら一連のステップの有効性を検討中である。合わせて、read-out T細胞からネオアンチゲン特異的治療用T細胞への転用へ向けて、TCRα/β遺伝子に人為的に変異を導入して抗原親和性を高める技術を名古屋大学と共同開発した（業績3）。また、臨床試験で明らかになったTCR-T細胞の弱点である短い輸注後生着期間の克服に、HLA-A*24:02/WT1エピトープ複合体を認識する新しい独自のCAR-T細胞製造に成功した（業績5）。この様に、関連する技術開発を行いつつネオアンチゲン特異的遺伝子改変T細胞の製造を進めている。

今後の研究の推進方策

本研究２年目に当たる今年度は、①既知の骨髄性白血病driver変異の候補から、in silicoアルゴリズムを用いて抽出したネオアンチゲン候補エピトープからreverse immunology法を用いて30mer程度のロングペプチドの標的抗原の抽出を進める。
②対象とするdriver変異を持つ患者骨髄細胞検体から得たTリンパ球のTCR遺伝子解析を用いてCD8とCD4それぞれのread-out T細胞の作製を試みる。作成されたread-out T細胞を用いて上記ロングペプチドに含まれるよりT細胞活性化能の高いエピトープを選択して具体的なネオアンチゲンエピトープが含まれるかどうかを検討する。
③標的とするdriver変異を持つ患者骨髄性白血病細胞が持つ遺伝子変異をNSGにより解析する準備を進める。これにより、同遺伝子変異を含む領域のアミノ酸配列が患者個々で保存されているかどうかを確認して、より患者間で保存された臨床的使用頻度が高いことが期待されるパブリックネオアンチゲンの選択を試みる。
④Read-out T細胞から治療用エフェクターT細胞への転換を想定して、標的ネオアンチゲン候補エピトープと想定したHLAとの複合体を認識する我々独自のTCR-T細胞様CAR-T細胞作製へ向けたモノクローナル抗体のスクリーニングを開始する。
⑤並行して、白血病driver遺伝子変異にコードされる非自己パブリックネオアンチゲンを標的とする細胞免疫療法の臨床応用へ向けたモデルとして、ATL白血病前駆細胞であるHTLV-1感染細胞を標的とするHTLV-1 Taxタンパク特異的TCR遺伝子を導入した同種γ/δ-T細胞療法の臨床試験実施へ向けた具体的な準備をさらに進める。これらの研究を進めて、引き続きパブリックネオアンチゲンを標的とする新たな細胞免疫療法の実現を目指す。

次年度使用額が生じた理由

試薬やNOGマウスの購入が年度末に掛かり搬入が４月初めとなったため使用額に差額が生じたが、研究計画の内容に従って、ベクター開発、細胞培養関連、遺伝子導入試薬、NOGマウス購入と飼育、in vivo imaging実験の費用に研究費を充てる。また、現在得られた結果を、学会等で成果を発表する旅費や国際雑誌に論文発表する経費等にその一部を充てる。

研究成果

• [雑誌論文] A retrospective analysis of haplo-identical HLA-mismatch hematopoietic transplantation without posttransplantation cyclophosphamide for GVHD prophylaxis in patients with adult T-cell leukemia-lymphoma. (2019)
  • 著者名/発表者名: Yoshimitsu M, Utsunomiya A, Fuji S, Fujiwara H, Fukuda T, Ogawa H, Takatsuka Y, Ishitsuka K, Yokota A, Okumura H, Ishii K, Nishikawa A, Eto T, Yonezawa A, Miyashita K, Tsukada J, Tanaka J, Atsuta Y, Kato K; ATL Working Group of the Japan Society for Hematopoietic Cell Transplantation.
  • 雑誌名: Bone Marrow Transplant. 巻: 54(8) ページ: 1266-1274
  • DOI: 10.1038/s41409-018-0400-5.
  • 査読あり
• [雑誌論文] 急性リンパ性白血病に対するCAR-T細胞療法-その現状と展望 (2019)
  • 著者名/発表者名: 藤原 弘
  • 雑誌名: 医学のあゆみ 巻: 268(1) ページ: 54-60
• [雑誌論文] Cytomegalovirus reactivation is associated with increased mortality more than 100 days after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation for adult T-cell leukemia-lymphoma. (2019)
  • 著者名/発表者名: Sawayama Y, Itonaga H, Fukushima T, Nakano N, Fujiwara H, Utsunomiya A, Fukuda T, Miyamoto T, Eto T, Miyashita K, Nakamae H, Ogata M, Yamanoha A, Miyazaki Y, Kanda J, Atsuta Y, Kato K; ATL Working Group of the Japan Society for Hematopoietic Cell Transplantation.
  • 雑誌名: American Journal of Hematology 巻: 94(5) ページ: E143-E146
  • DOI: 10.1002/ajh.25438.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Improving TCR affinity on 293T cells. (2019)
  • 著者名/発表者名: Ohta R, Demachi-Okamura A, Akatsuka Y, Fujiwara H, Kuzushima K.
  • 雑誌名: Journal of Immunological Methods 巻: 466 ページ: 1-8
  • DOI: 10.1016/j.jim.2018.11.010.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Follow-up of a randomised phase II study of chemotherapy alone or in combination with mogamulizumab in newly diagnosed aggressive adult T-cell leukaemia-lymphoma: impact on allogeneic haematopoietic stem cell transplantation. (2019)
  • 著者名/発表者名: 7)Ishida T, Jo T, Takemoto S, Suzushima H, Suehiro Y, Choi I, Yoshimitsu M, Saburi Y, Nosaka K, Utsunomiya A, Kobayashi Y, Yamamoto K, Fujiwara H, Ishitsuka K, Yoshida S, Taira N, Imada K, Kato K, Moriuchi Y, Yoshimura K, Takahashi T, Tobinai K, Ueda R.
  • 雑誌名: British Journal of Haematology 巻: 184(3) ページ: 479-483
  • DOI: 10.1111/bjh.15123.
  • 査読あり
• [雑誌論文] 再発・難治性多発性骨髄腫に対するCAR-T細胞療法の開発状況と今後の展開 (2019)
  • 著者名/発表者名: 藤原 弘
  • 雑誌名: 血液内科 巻: 78(1) ページ: 50-55
• [雑誌論文] Dasatinib-induced anti-leukemia cellular immunity through a novel subset of CD57 positive helper/cytotoxic CD4 T cells in chronic myelogenous leukemia patients. (2018)
  • 著者名/発表者名: Watanabe N, Takaku T, Takeda K, Shirane S, Toyota T, Koike M, Noguchi M, Hirano T, Fujiwara H, Komatsu N.
  • 雑誌名: International Journal of Hematology 巻: 108(6) ページ: 588-597
  • DOI: 10.1007/s12185-018-2517-0.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Antitumor activity of CAR-T cells targeting the intracellular oncoprotein WT1 can be enhanced by vaccination. (2018)
  • 著者名/発表者名: Akahori Y, Wang L, Yoneyama M, Seo N, Okumura S, Miyahara Y, Amaishi Y, Okamoto S, Mineno J, Ikeda H, Maki T, Fujiwara H, Akatsuka Y, Kato T, Shiku H.
  • 雑誌名: Blood 巻: 132(11) ページ: 1134-1145
  • DOI: 10.1182/blood-2017-08-802926.
  • 査読あり
• [雑誌論文] CD4 and CD8 dual-positive, CD25 negative, tumor cell phenotype in a patient with adult T-cell leukemia/lymphoma. (2018)
  • 著者名/発表者名: Casey N, Fujiwara H, Azuma T, Murakami Y, Yoshimitsu M, Masamoto I, Nawa Y, Yamanouchi J, Narumi H, Yakushijin Y, Hato T, Yasukawa M.
  • 雑誌名: Leukemia & Lymphoma 巻: 59(11) ページ: 2740-2742
  • DOI: 10.1080/10428194.2018.1439168.
  • 査読あり
• [雑誌論文] がん微小環境と腫瘍免疫の最前線 (2018)
  • 著者名/発表者名: 藤原 弘
  • 雑誌名: 臨床血液 巻: 59(10) ページ: 35-44
• [雑誌論文] 遺伝子改変技術・ゲノム編集技術のCAR-T細胞療法への応用 (2018)
  • 著者名/発表者名: 藤原 弘
  • 雑誌名: Pharma Medica 巻: 36(11) ページ: 45-50
• [雑誌論文] びまん性大細胞型B細胞リンパ腫に対するCD19を標的とするCAR-T細胞療法の開発現状と今後の展開 (2018)
  • 著者名/発表者名: 藤原 弘
  • 雑誌名: 血液内科 巻: 77(4) ページ: 481-487
• [雑誌論文] 次世代型CAR-T細胞療法の展望 (2018)
  • 著者名/発表者名: 藤原 弘
  • 雑誌名: Bio INDUSTRY 巻: 35(7) ページ: 47-56
• [雑誌論文] AMLに対する免疫療法の可能性 (2018)
  • 著者名/発表者名: 丸田雅樹、谷本一史、藤原 弘
  • 雑誌名: 血液内科 巻: 76(2) ページ: 216-221
• [学会発表] がん微小環境と腫瘍免疫の最前線 (2018)
  • 著者名/発表者名: 藤原 弘
  • 学会等名: 第80回日本血液学会学術集会 教育講演EL-2-4A
  • 招待講演
• [学会発表] 難治性骨髄腫を標的とした改変抗体T細胞免疫療法 (2018)
  • 著者名/発表者名: 丸田 雅樹, 越智 俊元, 谷本 一史, 東 太地, 斉藤 卓, 藤原 弘, 今村 健志, 安川 正貴
  • 学会等名: 第80回 日本血液学会学術集会
• [備考] 三重大学大学院医学系研究科遺伝子・免疫細胞治療学・個別化がん免疫治療学
  • URL: http://www.shikuken.jp/
• [備考] 愛媛大学大学院医学系研究科 血液・免疫・感染症内科学
  • URL: https://www.m.ehime-u.ac.jp/school/int.med1/