| 研究課題/領域番号 |
18K08574
|
|---|
| 研究機関 | 関西医科大学 |
|---|
研究代表者 |
福田 尚代 (西田尚代) 関西医科大学, 医学部, 助教 (00802703)
|
|---|
| 研究分担者 |
福田 信治 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 講師 (70398238)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| キーワード | Par3 / exocyst / CRISPR/Cas9 / 細胞生存 |
|---|
| 研究実績の概要 |
細胞極性の消失は多くのがん種で認められており、がんの悪性度を見極める上での一つの指標となっている。細胞極性因子Partitioning defective 3 (Par3)は乳癌細胞で発現が低下しており、予後不良と関連する。一方で、正常乳腺細胞ではPar3はexocyst複合体と結合することで細胞生存を維持していることが報告された。しかし、その分子機構は不明な点が多い。本研究は、正常乳腺細胞において細胞生存に必要なPar3-exocyst複合体の分子機構を解明し、乳癌細胞株におけるPar3-exocyst複合体の役割を明らかにすることを目的とする。
CRISPR/Cas9システムを用いて３次元培養が可能であるヒト乳腺上皮細胞MCF10Aのexocyst subunit-sfGFPノックイン細胞を作成した。細胞極性形成過程におけるexocyst subunitの細胞内局在をタイムラプス撮影により解析するために、樹立したノックイン細胞株を用いてMatrigel上にて乳房様構造aciniを作成を試みた。予想に反し、コントロール群と比較するとノックイン細胞株ではacini形成効率が低く、解析に十分な数を得ることができなかった。考えられる理由として(1) オフターゲットによる非特異的機能消失、(2) EGFRシグナル経路に対する応答性の低下が考えられる。(1) に対しては、複数のクローンを用いて実験を行い、クローン間の差異を評価することを検討している。(2) の可能性については、生化学的解析から評価を行う。今回は、内在性発現量が高いサブユニットから優先的にノックイン細胞を作成したが、残りのサブユニットでもノックイン細胞を作成し、３次元培養可能なノックイン細胞株を探索する。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
研究代表者の異動に伴い、研究環境を新たに構築する必要性が生じたため、進行に遅れが生じている。
|
| 今後の研究の推進方策 |
本研究に最適なノックイン細胞株を選択するためには、複数のノックイン細胞を樹立する必要がある。そのため、高効率にゲノム編集することができるCas9-gRNA ribonucleoproteins (RNP)とsingle-stranded oligodeoxynucleotides (ssODN)を使った方法を試す。また、蛍光タンパク質の遺伝子挿入による機能障害を回避する方法も模索する必要があり、現在取り組んでいる。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
研究代表者が年度途中に所属研究機関を変更し、研究環境の立ち上げに時間を要したため。
|
