| 研究課題/領域番号 |
18K08574
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| 研究機関 | 関西医科大学 |
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研究代表者 |
福田 尚代 (西田尚代) 関西医科大学, 医学部, 助教 (00802703)
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| 研究分担者 |
福田 信治 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 講師 (70398238)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | exocyst / Par3 / CRISPR/Cas9 / 細胞生存 |
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| 研究実績の概要 |
細胞極性の消失は多くのがん種で確認されており、がんの悪性度を判断する際に1つの指標として用いられている。細胞極性因子Partitioning defective 3 (Par3)は乳がん細胞で発現が低下しており、予後不良と関連する。一方で、正常乳腺上皮細胞ではPar3はexocyst複合体と結合することで細胞生存を維持していることが報告された。しかし、その分子機構は不明な点が多く、さらなる解析が求められている。本研究課題では、ヒト正常乳腺上皮細胞におけるPar3-exocyst複合体が持つ役割を分子レベルで解析し、乳がん細胞株でのその役割がどのように変動しているかを明らかにする事を目的としている。
ヒト乳腺細胞株MCF10Aは３次元培養によりacini様構造を形成するため、細胞極性の開始、形成過程、最終形態までをイメージングにより経時的に観察できる優位性を持っている。細胞極性形成過程におけるexocyst subunitsの細胞内局在を詳しく調べる目的で、MCF10A細胞を用いてexocyst subunit-GFPノックイン細胞株を樹立した。樹立したノックイン細胞株をMatrigel上で３次元培養したところ、acini様構造の形成効率が悪く、解析に支障を生じた。そのため、GFPなどの蛍光タンパク質の代わりにサイズの小さなペプチドタグを挿入した新たなノックイン細胞株の樹立を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
樹立したノックアウト細胞株に問題が生じたため、新たに別の解析方法を試す必要が生じた。現在は、ペプチドタグを挿入したノックイン細胞の作製を進めており、樹立後に解析を行う予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
Cas9, gRNA, ssODNを用いて、ペプチドタグを挿入したノックイン細胞株を作製し、免疫染色にてexocyst subunitの細胞内局在を解析する。その他にHaloタグを用いた解析系の確立も検討する。また、acini様構造の形成効率低下の原因としてEGFRシグナルのリガンド応答性の低下が考えられるため、細胞表面でのEGFRの発現を増加させた後に３次元培養を行うなど、最適な培養方法の検討も並行して進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2018年度中に研究代表者が所属を変更し、研究環境の立ち上げに時間を要したことが影響して全体的に研究課題の実施が遅れているため。
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