| 研究課題/領域番号 |
18K08705
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
堀 裕一 神戸大学, 保健学研究科, 教授 (80248004)
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| 研究分担者 |
清水 一也 神戸大学, 保健学研究科, 保健学研究員 (50335353)
三好 真琴 神戸大学, 保健学研究科, 助教 (50433389)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 膵癌 / エクソソーム / 肝転移 |
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| 研究実績の概要 |
研究の全体構想は膵癌細胞の遠隔転移機構を明らかにして新規治療法を開発することである。膵臓癌は癌死亡率の第４位にあり、早期診断が困難できわめて予後不良の疾患であり、遠隔転移や局所浸潤が予後を左右する。我々はこれまでに正常膵幹細胞と高悪性度のヒト膵癌細胞が幹細胞マーカー(CD133)を発現することを明らかにした(Stem Cells 2008; Pancreas 2009; Pathobiology 2011)。また、既存の抗がん剤Gemcitabine(GEM)に耐性の膵癌患者から10種類のCD133陽性膵癌幹細胞株を樹立し、細胞外基質を再構築することで自己複製能を獲得することを明らかにした(PLoS One, 2013)。また、これまでにマウス膵臓組織幹細胞にGreen Fluorescent Protein、変異型KRASG12D、変異型p53、cyclin dependent kinase 4を遺伝子導入してマウス人工膵癌細胞(親株)を作成している。さらに、in vivoで作成した親株由来腫瘍にGEMを長期投与することにより、耐性を獲得した腫瘍からGEM耐性株を樹立した。本研究では、我々が樹立作成した(1)ヒト膵癌幹細胞株と(2)マウス人工膵癌幹細胞株由来のエクソソームによる肝臓でのpre-metastatic nicheを再構築し、転移機構を分子レベルで解明し、新規治療薬の開発を目指す。初年度は、それぞれの細胞由来のエクソソームを分離して、マウスに投与すると対照群に比べて明らかに肝転移が亢進することを明らかにした。また、この機序としてエクソソームにより血管透過性の亢進が誘導される可能性を見出した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
(1) ヒト膵癌幹細胞株由来エクソソームによるpre-metastatic nicheの解析
初年度は転移過程のうち膵癌細胞のextravasationに絞って解析した。癌性腹膜炎による腹水貯留患者に対して緩和ケアで行われるCell-free and Concentrated Ascites Reinfusion Therapy療法の膵癌患者の腹水からエクソソームを分離した。一方、コントロールとしては肝硬変患者の腹水由来のエクソソームや市販のリポソームを用いた。エクソソームの確認はナノサイトで行った。免疫不全マウスにエクソソームを投与したのち、当研究室で樹立したGFPラベルのヒト膵癌細胞を投与し、GFP染色により肝転移を解析した結果、コントロールに比較して膵癌細胞由来エクソソーム投与群で有意に肝転移が亢進した。また、エクソソーム投与によりdextran漏出が亢進したことから、血管内皮細胞のtight junctionの破壊が転移を亢進させる可能性が明らかになった。
(2) マウス人工膵癌幹細胞由来エクソソームによるpre-metastatic nicheの解析
初年度は、マウス組織幹細胞に遺伝子導入して樹立したマウス人工膵癌幹細胞株(親株)を使って、in vivoで腫瘍形成させたのちにGEMを長期投与して、一旦腫瘍が縮小効果を示したのちに再度増大傾向を示した腫瘍からGEM耐性マウス人工膵癌細胞(耐性株)を樹立した。耐性株はGEM耐性/高転移株であることを確認した。親株と耐性株の培養上清から分離したエクソソームを野生型マウスに投与して、その後に親株細胞を移植すると耐性株由来エクソソーム投与群では明らかに肝転移が亢進した。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究では、我々が樹立作成した(1)ヒト膵癌幹細胞株と(2)マウス人工膵癌幹細胞株由来のエクソソームによる肝臓でのpre-metastatic nicheを再構築し、転移機構を分子レベルで解明し、新規治療薬の開発を目指す。初年度の実績ではマウス人工膵癌細胞親株由来腫瘍にin vivoでのGEM長期投与によりGEM耐性を獲得した腫瘍からGEM耐性マウス人工膵癌細胞(耐性/高転移株)を樹立した。さらに、ヒト膵癌幹細胞株やマウス人工膵癌耐性/高転移株由来のエクソソームによる肝転移の亢進をin vivoで証明した。今後は、エクソソームによる転移亢進機構やpre-metastatic niche構築の分子メカニズムを明らかにするため、血管内皮細胞や膵癌細胞に及ぼす影響をin vitro実験系でリアルタイムPCRやWestern blotting法により解析する予定である。また、血管透過性亢進やtight junctionの障害に関しては蛍光ラベルしたデキストランの漏出実験やtight junction構成分子(ZO-1, occludin, claudin)の免疫染色により検討する。一方で、エクソソームの転移亢進因子の同定のために、マウス人工膵癌細胞親株と耐性株のマイクロアレイの結果から、転移促進候補となる遺伝子を抽出してリアルタイムPCRやWestern blotting法や免疫染色により確認を行いたい。また、ヒト膵癌幹細胞株のエクソソームに含まれるmicroRNAを網羅的に解析することで転移を亢進させる遺伝子候補の解析にも着手する予定である。
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