| 研究課題/領域番号 |
18K11141
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| 研究機関 | 藤田医科大学 |
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研究代表者 |
釘田 雅則 藤田医科大学, 疾患モデル教育研究サポートセンター, 講師 (50440681)
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| 研究分担者 |
熊本 海生航 藤田医科大学, 疾患モデル教育研究サポートセンター, 講師 (10469322)
吉村 文 藤田医科大学, 疾患モデル教育研究サポートセンター, 講師 (90466483)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 多発性嚢胞腎症 / モデル動物 |
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| 研究実績の概要 |
多発性嚢胞腎症（PKD）は、腎臓をはじめとする臓器に多数の嚢胞を形成する遺伝性の腎疾患である。その責任遺伝子として、PKD1とPKD2が同定されているが、変異のホットスポットは見つかっていない。そのため、PKD患者の病態と責任遺伝子の変異箇所がデータベースとしてまとめられている。PKD1とPKD2遺伝子から作られるタンパク質PC1、PC2は複合体を形成することが知られており、その立体構造も解析されている。
PKDモデル動物のほとんどがノックアウトかコンディショナルノックアウトマウスである。これらのマウスは、病態を示さなかったり、病態進行がヒトと異なり極端に早かったりする。数は少ないが、塩基置換に伴うアミノ酸置換のPKDモデル動物は病態の進行が遅く、ヒトに近い病態を示す。これらのことは、PKDの病態は責任遺伝子の機能消失では再現することが難しく、アミノ酸置換による機能低下の方がモデル動物を作成する上で望ましいことを示唆する。
今年度、PKD患者の責任遺伝子の変異箇所のデータベースとPC1,PC2の複合体の構造を基にPKD1遺伝子に変異を入れる場所を複数決定した。そして、CRISPR-Cas9を用いて、それらの変異を入れたノックインマウスを作成した。ノックインマウスの作成は、CRISPAR-CAS9による切断、その後の相同修復によって行われる。その際、CRISPAR-CAS9により何塩基か削られる、もしくは、切断箇所に何塩基か挿入されることによりフレームシフトが起こったマウスも得られる。
今後は、目的のノックインマウスのヘテロ、ホモの病態の経時的な解析、ノックインマウス同士の交配を行い、複数のアミノ酸置換が及ぼす病態への影響の解析、ノックインマウスとフレームシフトマウスの交配による機能消失と機能低下に伴う病態への影響の解析を行う予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
Pkd1-/-は胎生致死になることが報告されている。CRISPR-Cas9を用いたノックインマウスの作成では、ゲノムが切断された後、変異を入れた1本鎖DNAと相同修復が行われることによりノックインマウスを得る。一般的なCRISPR-Cas9の使用条件では、ゲノムの切断効率が良すぎ、相同修復が行われなかったため、胎生致死となり、仔を得られることが出来なかった。そこで、ゲノムの切断効率を下げる条件検討を行った。また、変異が入るかどうかは相同修復が行われるかどうかであり、確率論になる。今年度は、条件検討と複数回のノックインマウスの作成に時間を費やした。目的のノックインマウスが得られたため、来年度、解析を行う。
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| 今後の研究の推進方策 |
CRISPR-Cas9を用いて、Pkd1遺伝子に1-2塩基のノックインを行い、アミノ酸置換したゲノム編集マウスを数種類作成した。その際、Pkd1遺伝子がフレームシフトしたマウスも得られた。今後は、ノックインマウスのヘテロ及びホモの病態を経時的に解析する。また、1つの変異だけでなく、複数の変異を持つ場合に、病態がどのように変化するかを検討するために、複数のゲノム編集マウスの交配を行い、病態を経時的に解析する。さらに、ノックインマウスとフレームシフトマウスの交配を行い、Pkd1遺伝子の機能低下と機能消失に伴う病態への影響の解析を行う予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2021年度は、モデル動物作成の条件検討に時間がかかり、目的の動物を得るのが遅くなった。そのため、病態解析がほとんど行えなかった。2022年度は得られたモデル動物の病態解析のために研究費を使う予定である。
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