研究課題
DNA二本鎖切断（DSB）は、相同組換え経路（HR）か非相同末端連結経路で修復されるが、その選択機構は明らかになっていない。これまでの報告から、DNA切断端での一本鎖DNAの露出（DNA end resection）が、HR経路へ進む最初のステップと考えられている。 しかし、resectionが起こるきっかけについては分かっていない。研究代表者らは、転写およびDNA-RNA hybrid構造がHRに重要であることを見出しており、DSB周辺でRNA分子により形成されるループ構造（R-loop）がresectionを促進している可能性が考えられる。本研究では、DSB周辺のR-loopがresectionの引き金となりうるかどうか、明らかにすることを目的としている。転写阻害剤を用いて検証した結果、HR経路の責任因子Rad51のDNA損傷への集積に、DSBに加え、シスプラチンでも強い影響が見られた。さらに、DNA損傷応答因子である53BP1の集積にも影響が見られたことから、シスプラチンによるDNA鎖間架橋（ICL）に対しては、HRのみならず損傷応答そのものにも転写が影響しうることが示唆された。そこで、ICL応答への転写阻害剤による影響の解析を進めたが、転写阻害剤がDNA複製を抑制してしまうことが明らかとなり、DNA複製依存的に引き起こされるICL応答では、転写阻害剤による解析が困難となった。そこで改めてDNA損傷をDSBへと絞って解析を進めており、Rad51以外の因子の集積も転写依存的であることを示唆するデータを得ている。現在は、これらの影響がR-loopの形成に依存するか検証するため、RNaseH1を人為的に発現誘導できる細胞株の樹立を進めている。
3: やや遅れている
ICL応答において、転写との興味深い関連の可能性が示唆されたため解析を進めたが、転写阻害剤処理により、DNA複製そのものが低下してしまうことが明らかとなった。ICLはDNA複製の進行を阻害することでDNA損傷応答を引き起こし、HRにより修復および複製の再開が行われる。したがって、DNA複製自体が抑制されてしまう条件下では、そもそものDNA損傷応答が弱い可能性が考えられ、結果の評価ができなくなってしまった。様々な条件検討を行ったが、現状では転写抑制の影響と、複製抑制による影響とを区別できておらず、研究の進捗としてはやや遅れている。
転写阻害剤を用いて得られている結果が、R-loopを介したものであるかどうか検証するため、DNA-RNA hybridを消化するRNaseH1の過剰発現をテトラサイクリンで誘導できる細胞株の作成を進めている。RNaseH1を一過性に誘導することで転写阻害剤と同様の影響が確認されれば、R-loopの形成が重要であると考えられる。また、DSBを細胞内のテトラサイクリン誘導性プロモーターの下流で人為的に誘導できる実験系を用い、そのDSB部位へのHR関連因子、およびresection関連因子の集積と転写との関連を調べていく。
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すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (3件) (うち国際学会 1件、 招待講演 1件) 備考 (1件)
Nucleic Acids Research
巻: 46 ページ: 2932-2944
10.1093/nar/gky058.
https://kmu-bc1.jimdo.com/
