| 研究課題/領域番号 |
18K14560
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| 研究機関 | 長岡技術科学大学 |
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研究代表者 |
上村 直史 長岡技術科学大学, 工学研究科, 助教 (50646528)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | リグニン / フェルラ酸 / バニリン酸 / センサー / バクテリア / 蛍光タンパク質 / 転写制御 |
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| 研究実績の概要 |
リグニンは自然界において「真菌等による低分子化分解」と「生成した芳香族化合物のバクテリアによる代謝」を経て無機化されると考えられている。本研究では環境中でのリグニン生分解挙動を調査するツールの開発を目指し、リグニン由来芳香族のモデル分解菌であるSphingobium sp. SYK-6株を宿主とし、本株の転写制御システムを応用することによりリグニン由来の低分子芳香族化合物を検出できるセンサーバクテリアを開発することを目的としている。
これまでに、フェルラ酸の代謝時に特異的に誘導されるSYK-6株のferBプロモーターをeGFP遺伝子の上流に連結したレポータープラスミドを構築し、本プラスミドを保持したSYK-6株がフェルラ酸を特異的に検出できることを明らかにした。しかし、本センサーは感度が低く、10 mM以上のフェルラ酸を要求したことから、今年度は本センサーの感度向上を目的とした改良を実施した。1) 蛍光活性の向上を期待して蛍光タンパク質としてsuperfolder GFPを検討、2) ferBプロモーター活性の制御を厳密化するためにレポータープラスミドに本プロモーターのリプレッサーをコードするferCを導入、3) より低濃度のフェルラ酸にも応答できるようにするためにFerCのエフェクター分子であるフェルロイルCoAを蓄積するferB ferB2破壊株を作製しセンサーの宿主として利用、4) フェルラ酸からフェルロイルCoAを生成するフェルロイルCoAシンターゼをコードするferAをレポータープラスミドに導入、これらの改良を重ねた結果、0.001 mMフェルラ酸を検出することができ、センサーの感度を1万倍に向上させることに成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまでに構築したセンサーのフェルラ酸応答感度は悪く10 mM以上のフェルラ酸を要求した。そこで今年度はセンサーの感度向上を目的として、以下の4つの観点を基に改良に取り組み、1) 高感度蛍光タンパク質の選抜、2) 制御の厳密化、3) エフェクター分子の蓄積、4) エフェクター分子生産能、30種類を超えるセンサーバクテリアについて評価を実施した。その結果、1万倍の感度向上に成功し0.001 mMフェルラ酸を検出可能なセンサーを構築できた。また、フェルラ酸だけでなく、バニリン酸、アセトバニロン、ビフェニル型化合物といったリグニン由来芳香族化合物の検出のためのレポータープラスミドの構築がほぼ完了している。
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| 今後の研究の推進方策 |
１）センサーの改良：センサーの多用途化を目的としてレポータープラスミド上のセンサー領域をゲノムに組み込む計画がある。コピー数減少に伴いセンサー応答時の蛍光活性の低下が予想されるため、ferBプロモーターの-35及び-10配列をSYK-6株の高発現プロモーターを参考に改変し活性向上を狙う。
２）多様なリグニン由来芳香族化合物のセンサー開発：バニリン酸、アセトバニロン、ビフェニル型化合物で誘導されるプロモーターと制御システムを利用したレポータープラスミドがほぼ完成していることから、これらのセンサーとしての評価を実施する。
３）環境試料への適応：改良型フェルラ酸センサーバクテリアを用いて土壌懸濁液への適応試験を予備的に実施した結果、いくつかの試料において蛍光が検出できた。今後は試料の調製方法等を確立し、水圏試料など多様な環境について評価を進める。
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