| 研究課題/領域番号 |
18K14629
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| 研究機関 | 公益財団法人がん研究会 |
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研究代表者 |
高橋 元子 公益財団法人がん研究会, がん研究所 実験病理部, 研究員 (60793594)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | コンデンシン / 一本鎖DNA / 二本鎖DNA / 染色体凝縮 / 複製 / 転写 |
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| 研究実績の概要 |
2018年度までにヒトのコンデンシン複合体（IおよびII）のタンパク精製系を確立し、各種DNA基質との結合様式についてin vitroでの解析を行い、一本鎖DNAへの高い結合能を見出した。その結果をもとに、2019年度は転写や複製に伴い核内に形成される一本鎖DNA/RNAを足がかりとしたコンデンシン複合体のクロマチン結合のメカニズムの可能性について検討した。
１）コンデンシンIのセントロメア局在化機構について、セントロメアで転写され、その場にとどまるα-satellite RNAがコンデンシンIのセントロメアへの局在化に寄与するのかを検討した。 分裂期におけるα-satellite RNAに対するコンデンシンIの結合の有無をRIP解析で検討した結果、結合は認められなかった。よってコンデンシンIのセントロメア局在化はα-satellite RNAを介したものではなく、他の機序が存在すると考えられる。
２）DNA複製機構と連動したコンデンシンIIのクロマチン局在化機構の存在を確認するため、iPOND法を用いて、EdUラベルされた複製部クロマチンを精製し、コンデンシンIIの結合の有無の評価を試みたが、同方法では結合を検出できなかった。そこでコンデンシンIIの間期におけるクロマチンへの動的結合状態をFRAP実験により解析した。内在性コンデンシンIIと、その局在から細胞周期の指標となるDHBをそれぞれ蛍光標識した細胞株を樹立し、G1、S、G2期でのコンデンシンIIのDNA結合の動的状態を評価する系を樹立した。コンデンシンIIは間期においてクロマチンとダイナミックに結合することが分かり、またS期以降にクロマチンへの結合がより安定的な成分が増加する傾向を見出した。このことは複製とリンクしたコンデンシンIIのクロマチン局在機構の存在を示唆する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
計画した実験はほぼ予定通り実施した。
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| 今後の研究の推進方策 |
2020年度は下記の実験を進める。
１）転写機構のコンデンシンのクロマチン局在化機構への関連性の解析
転写阻害剤等を用いて、コンデンシンのクロマチン結合動態の変化についてFRAP解析にて検証する。
２）間期における核内コンデンシンIIの役割を検証する。
2019年度の結果から、S期以降コンデンシンIIのクロマチンへのより安定的な結合が見られるようになることから、コンデンシンIIがS期にクロマチン結合できない状態を作り出した際の、クロマチン/染色体構造への影響について解析する。
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