| 研究課題/領域番号 |
19H00982
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
上田 昌宏 大阪大学, 生命機能研究科, 教授 (40444517)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 走化性 / 三量体Gタンパク質 / GPCR / 適応 / 細胞性粘菌 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では，三量体G蛋白質の細胞質-細胞膜間局在制御の仕組みを解明し，「G蛋白質局在制御によるGPCRシグナリングの調節」という新しいコンセプトの確立を目指した研究を実施している．これまでの研究から，G蛋白質局在制御はGPCRの応答濃度レンジの拡張に働いていること，および，三量体G蛋白質と結合する細胞質因子のGip1がG蛋白質局在制御を担う中心的な分子であることを明らかにしてきた．そこで本研究では主に次の３つの研究項目を実施してきた．
[研究項目1] 細胞質におけるGip1とG蛋白質の複合体形成の分子メカニズム
[研究項目2] リガンド刺激によるGip1-G蛋白質複合体の調節メカニズム
[研究項目3] G蛋白質局在調節メカニズムの普遍性
本年度は，[研究項目1]としてGip1の構造解析を進めた．これまでにGip1のC末ドメインがcavityを有しており，ここがG蛋白質の脂質修飾（ゲラニルゲラニル基）と相互作用することで，複合体が形成されることが示唆されてきた．しかしながら，これまでの立体構造解析からは，ゲラニルゲラニル基との相互作用について明らかになっていなかった．本年度は，Gip1のC末ドメインとゲラニルゲラニル基が結合した立体構造の解析に成功し，cavity内にゲラニルゲラニル基が挿入されている構造が明らかになった．[研究項目2]として昨年度までにGip1のN末ドメインを構成するPHドメインが複合体形成の調節に重要であることを明らかにしてきた．本年度はこのPHドメインに作用するシグナル伝達分子の探索を行った．候補となる分子の代謝に関わる遺伝子の変異株を解析したところ，Gip1とG蛋白質の複合体形成の量に影響する変異株を見つけることができた．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
昨年度に引き続きGip1-G蛋白質複合体の構造解析（[研究項目1] ）を進めた結果，上述したように，G蛋白質との相互作用に関わるGip1 C末ドメインがG蛋白質のゲラニルゲラニル基と相互作用することが立体構造解析から明らかになった．また，リガンド刺激によるGip1-G蛋白質複合体の調節メカニズム（[研究項目2] ）については，昨年度までにGip1のPHドメインの重要性が明らかとなっていた．PHドメインは細胞膜のイノシトールリン脂質と結合することが知られているが，Gip1は細胞質に局在することから，PHドメインが受け取るシグナルは細胞質に遊離した状態で存在するイノシトールリン脂質かその分解産物が候補となる．本年度は，そうした候補分子としてイノシトールポリリン酸に注目し，その代謝に関わるいくつかの酵素分子の遺伝子破壊株を作成した．それを用いてGip1-G蛋白質複合体の形成量などについて解析をすすめた結果，ある遺伝子破壊株においてGip1-G蛋白質複合体の量に異常が見つかってきた．[研究項目3] については，Gip1のヒト細胞ホモログであるTNFAIP8ファミリーのTIPE2， TIPE3に注目し，相互作用分子の同定を進めてきた．これらの研究はおおむね計画通りに進めることができている．
これらの研究に加え，本研究に関連してGPCR依存的な走化性応答の濃度レンジを定量的に計測するための手法を開発した．微小流路を利用することにより，走化性を誘導する誘引物質の濃度勾配を再現性よく形成することが可能になり，様々な誘引物質濃度レンジにおける応答性を定量することが可能になった．その結果，細胞集団の一部に非常に高い応答性を有するサブ集団が存在することが明らかとなった．そのサブ集団が走化性応答を示す際に必要な最小の誘引物質結合数は，細胞あたり平均で6個であることがわかった．
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| 今後の研究の推進方策 |
当初に計画した３つの研究項目を軸にして研究を進めていく．特に，Gip1の立体構造解析についてさらに進め，複合体形成の分子メカニズムの解明に取り組む．複合体形成の調節メカニズムを解明するために，Gip1のN末のPHドメインの構造解析とGip1の全体構造の解析を進める．また，Gip1-G蛋白質複合体の調節に関わることが示唆されたイノシトールポリリン酸について，その代謝に関連する遺伝子群の解析をすすめ，遺伝子ノックアウト株の表現型を解析する．細胞質のPHドメインに作用するシグナル分子は他の細胞系においても全く知られていない．同定できれば新規性は高いので，この未知のシグナルの同定を進める．また，微小流路を用いた走化性応答レンジ計測系を確立することができたので，これを利用して様々な遺伝子変異体のGPCR依存的な走化性の応答性を評価する．これにより，応答レンジ調節の仕組みに関与する可能性のある遺伝子群のスクリーニングを行い，Gip1との関係について検討する予定である．誘引物質が６個程度の少数分子による入力信号がGPCR-G蛋白質のダイナミクスによって大きく増幅される仕組みと，誘引物質が数万個以上入力する高濃度領域での応答が両立する仕組みの関係について，Gip1に着目した研究を行う予定である．
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