| 研究課題/領域番号 |
19H01173
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
牛田 多加志 東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 教授 (50323522)
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| 研究分担者 |
上田 太郎 早稲田大学, 理工学術院, 教授 (90356551)
古川 克子 東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 准教授 (90343144)
伊藤 弓弦 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究グループ長 (30500079)
佐藤 正人 東海大学, 医学部, 教授 (10056335)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 静水圧 / 軟骨細胞 / シグナル伝達 / 再生軟骨 |
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| 研究実績の概要 |
FRETベースのRas活性化状態プローブであるRaichu (Mochizuki et al., 2001)を用い、in vitroでRas活性の圧力感受性を測定することを目標に、機能的なRaichuを単離精製した。そして静水圧負荷下でリアルタイムでFRETを観測するための装置の設計・製作を実施し、静水圧制御、温度制御共に良好に行われることを確認した。
また、軟骨細胞に高静水圧を負荷することにより発現が上昇するc-fosおよびSOX-9について、その転写因子結合部位についての解析を進め、結合する転写因子の候補をピックアップした。
さらに、静水圧条件下において一定時間処理された軟骨細胞と、通常条件下で培養された比較対照群との間における、mRNA、lncRNA、miRNAの網羅的な遺伝子発現解析を行った。そして、メカニカルな入力に関与しうるシグナルパスウェイの抽出、mRNAとmiRNAの相互作用の探索を開始した。
再生軟骨組織移植モデルの開発においては、これまでに日本白色家兎並びにラットを用いた異種同所性移植モデルによる有効性評価をそれぞれ確立している。多指症由来軟骨組織より作製した細胞シートを用いて日本白色家兎並びにラットモデルへの細胞シート移植を行い、両動物種での修復再生効果の同等性について確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Raichuは動物培養細胞内で発現することが知られていたが、単離精製は行われていなかった。そこでわれわれはまずRaichuを大腸菌で発現したが、不溶性となり、refoldingの試みも成功しなかった。そこで昆虫細胞で発現させたところ、可溶性のRaichuを得た。このRaichuは、GTPやGDPの添加によりFRETが想定通りに変化し、正しく機能していることが確認された。高静水圧を負荷することにより発現が上昇するc-fosおよびSOX-9の転写因子結合部位について、ルシフェラーゼアッセイを通じて同定することができた。また、静水圧条件（24MPa, 25MPa）で22～24時間、軟骨細胞を処理した検体８種類とその比較対象８種類に関して、それぞれDNAマイクロアレイ解析、miRNAアレイ解析を終了した。また、軟骨細胞分化やメカニカルシグナルに関わる遺伝子群のリスト化を行った。その上で、「静水圧」が細胞に与えうる影響及びそのシグナルパスウェイの抽出作業を開始した。再生軟骨組織移植モデルの開発においては、日本白色家兎並びにラットモデルの組織染色及びICRSスコアリングによる組織学的評価等のデータを収集し評価した。データを集約し、現在論文投稿準備中である。当初の計画では日本白色家兎モデルで評価を行う予定であるが、ラットモデルによる評価も可能となった。
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| 今後の研究の推進方策 |
機能的なRaichuが得られたので、これに静水圧をかけてRasそのものが圧力感受性を持つかを検討する。さらに、GEFとGAPを組換えタンパク質として調製し、これらの調節因子存在下での圧力感受性も測定する予定である。高静水圧を負荷することにより発現が上昇するc-fosおよびSOX-9の転写因子結合部位が同定されたことにより、その転写部位に結合する転写因子が推定されるため、それらの転写因子活性化のシグナル伝達経路に焦点を当て、実験を進める予定である。また、「静水圧」が細胞に与えうる影響及びそのシグナルパスウェイを抽出すると共に、そのキーファクターと考えられる遺伝子を同定する。その上で、「静水圧」が細胞に与えうる影響を解析する上でGain of function、Loss of function実験を行うための候補遺伝子を提示する。そして、細胞分化・組織再生のin vitro実証研究により作製された再生軟骨組織を日本白色家兎並びにラットの軟骨損傷モデルに移植し、組織染色及びICRSスコアリングによる組織学的評価等を実施する。
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