| 研究課題/領域番号 |
19H02827
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
野村 渉 広島大学, 医系科学研究科(薬), 教授 (80463909)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | ゲノム編集 / CRISPR-Cas / 細胞周期 / オフターゲット作用 / タンパク質間相互作用 |
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| 研究実績の概要 |
本研究課題では多様な生物種において利用できるゲノム編集技術であるCRISPR-Cas9について、特に安全性が重要になる応用面での懸念事項であるオフターゲット作用を抑制するためにDNA切断作用とDNA修復機構がどのように関連してオフターゲット作用が現れるか、について独自に見出したAnti-CRISPR＋Cdt1の融合タンパク質の作用によるオフターゲット作用抑制をヒントに作用機序を解明し、普遍的原理を探求することを目的としている。今年度の研究実施内容とその成果としては以下のとおりである。1. SpCas9に対するAcrIIA4以外の作用解析、では当初予定していたAcrIIA1～A3に加えてAcrIIA5およびA6も追加してCdt1融合タンパク質を構築し、オフターゲット作用の抑制効果を検討した。その結果、AcrIIA4よりも阻害活性、およびオフターゲット作用抑制効果の高いドメインを見出すことができた。2. Cas9誘導体に対するAnti-CRISPR＋Cdt1による活性制御の拡張、についてはDNA切断活性を持たないdCas9を利用した転写活性化因子の作用を蛍光観察する仕組みを構築し、Anti-CRISPRによるCas9阻害のタイミングなどの詳細について解析を進めている。また、デアミナーゼによる塩基変換における作用についても解析を開始した。3. Anti-CRISPRタンパク質の候補遺伝子の探索、についてはSpCas9以外のCRISPR-CasシステムについてAnti-CRISPR候補を選定してゲノム編集におけるオフターゲット作用抑制効果に関する解析を開始した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当該年度に実施予定であった3項目の研究内容についてすべて実施することができた。特にAcrIIA1～A6（A4を除く）のオフターゲット作用抑制効果に関する検討については当初の予定よりも多くのAnti-CRISPRについて知見を得ることができた。また、転写活性化ドメインであるVPRと切断不活性型dCas9の融合体については細胞内で安定的に発現するシステムとすることでより詳細なゲノム編集作用のリアルタイム観察にも利用できると期待できる結果を得られている。またオフターゲット作用のゲノムワイド解析についてはシークエンス解析をベースとする手法を主に利用して着実に進められている。以上のことからこのように進捗状況を評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度の研究実施項目として以下の3項目を予定している。1. SaCas9, MbCas12aへのAnti-CRISPR＋Cdt1制御機構の適用：SaCas9についてはAcrIIA1～6の有効性を検証し、MbCas12aについてはAcrVA5を中心に関連するAnti-CRISPRタンパク質を利用して有効性を検証する。2. ゲノムワイド解析を利用した多様な標的遺伝子での効果検証：AAVS1以外を標的にした場合のオフターゲット作用の抑制についてもデータ蓄積を行う。3. Cdt1変異体を利用したより厳密な抑制系の構築：Cdt1はG1期での発現が示されているが、発現量の低減がS期まで続く。そのため、発現時間が厳密に制御されるCdt1を得ることでより高いオフターゲット作用抑制効果が期待できる。これまでの報告 (Sakaue-Sawano A. et al. Mol. Cell 2017) を参考に更に種々の変異体を検討し、最適なCdt1を取得する。また、Cdt1以外にも細胞周期に依存した発現量変化や核内局在量の変化を示すタンパク質ドメインが見出されているため、それらを利用したCas9活性制御についても検討を進める。
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