| 研究課題/領域番号 |
19H03692
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| 研究機関 | 東海大学 |
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研究代表者 |
細川 裕之 東海大学, 医学部, 特任講師 (60431756)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | Notchシグナル / T細胞初期分化 / 細胞の運命決定 / 転写因子ネットワーク / 発生段階特異的 / プロテオミクス解析 |
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| 研究実績の概要 |
造血幹細胞からTリンパ球への分化には、胸腺微小環境からのNotchシグナルが必須である。胸腺移入直後の 初期ProT細胞において、Notchシグナルは転写因子Tcf7やGATA3、Bcl11bの発現を誘導することで、T前駆細胞の持つB細胞や自然リンパ球やミエロイド系列への分化能を排除し、T細胞への運命を決定づける。T細胞への運命決定がなされた後期ProT細胞では、Rag1やRag2といったT細胞受容体の遺伝子再構成に関わる遺伝子群の発現がNotchシグナル依存的に誘導される。しかし、初期ProT細胞でNotch依存的にコントロールされていたTcf7やGATA3、Bcl11bはNotchシグナル非依存的に発現が維持される。そこで、本研究では、Notchシグナルがどのように発生段階特異的な機能を発揮するのか、T細胞初期分化をモデルとし、その分子メカニズムを明らかにする事を目的とする。
昨年度はCrispr/Cas9システムによりステージ特異的なNotchノックアウトProT細胞のRNA-seq解析を行い、多くの発生段階特異的なNotchターゲット遺伝子を同定した。さらに、Notchシグナルが発生段階特異的にターゲット遺伝子を制御するメカニズムとして、ステージ特異的な転写因子と会合している可能性が考えられる。そこで、Notch1-ICにMycおよびFlagタグを付加したレトロウイルス発現ベクターを作製し、Notch1-IC 会合分子のプロテオミクス解析を行い、昨年度はDN3細胞株を用いてNotch複合体の網羅的同定に成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
昨年度は、当初の計画通り細胞株を用いたDN3ステージにおけるNotch IC会合分子のプロテオミクス解析を行い、良好な結果を得た。さらに、これまで初代培養株では困難であったNotch ICのクロマチン免疫沈降解析について、２つのモノクローナル抗体を混ぜて使うことで、実験系の確立に成功した。さらに、Notchファミリー分子を発生段階特異的にノックアウトすることで、発生段階特異的なNotchターゲット遺伝子を多数同定した。
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| 今後の研究の推進方策 |
(A), 発生段階特異的にNotch1-ICに結合する分子群のプロテオミクス解析；Notchシグナルが発生段階特異的にターゲット遺伝子を制御するメカニズムとして、ステージ特異的な転写因子と会合している可能性が考えられる。そこで、Notch1-ICにMycおよびFlagタグを付加したレトロウイルス発現ベクターを作製し、Notch1-IC 会合分子のプロテオミクス解析を行う。昨年度DN3細胞株を用いてNotch複合体の網羅的同定に成功した。本年度は初代培養細胞を用いて、DN1/2a細胞、DN3細胞を用いてステージ特異的なNotch複合体構成分子の網羅的同定を目指す。
(B), ステージ特異的にNotch1-ICおよびRbpjの結合している遺伝子領域の同定；Notch-ICやRbpjに対するクロマチン免疫沈降 (ChIP)解析は抗体のqualityが原因で困難であったが、我々は細胞のクロスリンクの条件と、複数のモノクローナル抗体を混ぜて使用することで、ProT細胞におけるRbpjのChIPシークエンス解析を行うことに成功した。昨年度は、Notch-ICに対するChIP解析法の確立に成功した。本年度はduplicate以上でNotch-ICのChIP-seq解析を行い、reproducibleなNotch-IC会合領域を同定する。
(C), ステージ特異的にNotch1シグナルによって発現制御される遺伝子群の同定；昨年度、Crispr/Cas9システムによりステージ特異的なNotchノックアウトProT細胞のRNA-seq解析を行い、多くの発生段階特異的なNotchターゲット遺伝子を同定した。本年度は、これらの結果を論文にまとめ発表することを目指す。
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