| 研究課題/領域番号 |
19H03692
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| 研究機関 | 東海大学 |
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研究代表者 |
細川 裕之 東海大学, 医学部, 講師 (60431756)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | Notchシグナル / T前駆細胞 / 造血幹細胞 / 転写因子ネットワーク / 発生段階特異的 |
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| 研究実績の概要 |
造血幹細胞からTリンパ球への分化には、胸腺微小環境からのNotchシグナルが必須である。胸腺移入直後の 初期ProT細胞において、Notchシグナルは転写因子Tcf7やGATA3、Bcl11bの発現を誘導することで、T前駆細胞の持つB細胞や自然リンパ球やミエロイド系列への分化能を排除し、T細胞への運命を決定づける。T細胞への運命決定がなされた後期ProT細胞では、Rag1やRag2といったT細胞受容体の遺伝子再構成に関わる遺伝子群の発現がNotchシグナル依存的に誘導される。しかし、初期ProT細胞でNotch依存的にコントロールされていたTcf7やGATA3、Bcl11bはNotchシグナル非依存的に発現が維持される。そこで、本研究では、Notchシグナルがどのように発生段階特異的な機能を発揮するのか、T細胞初期分化をモデルとし、その分子メカニズムを明らかにする事を目的とする。昨年度までに、CRISPR/Cas9システムによりステージ特異的なNotchノックアウトProT細胞のRNA-seq解析を行い、多くの発生段階特異的なNotchターゲット遺伝子を同定した。今年度は、初期ProT細胞と後期ProT細胞を用いてNotch1-ICおよびNotch2-ICに対するChIP-seq解析を行い、Notch転写因子複合体が結合するゲノム領域がProT細胞の発生段階によってダイナミックに変化する事を明らかにした。さらに、T細胞分化プログラムを発動するNotchシグナルの中でもNotch1とNotch2が機能的な差異を持つメカニズムの解析に着手した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度は、これまで困難であったNotch1-ICおよびNotch2-ICのクロマチン免疫沈降解析について、２つのモノクローナル抗体を混ぜて使用することで、実験系の確立に成功した。すでに複数回のChIP-seq解析を行い、reproducibleなNotch1およびNotch2会合ゲノム領域の網羅的な同定に成功した。また、Notch1、およびNotch2依存的なターゲット遺伝子を探索する目的で、Notch1欠損リンパ球前駆細胞株、およびNotch2リンパ球前駆細胞株を樹立した。
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| 今後の研究の推進方策 |
(A), Notchシグナルの中でもNotch1とNotch2が機能的な差異を持つメカニズムの解明を目指す。Notch1、またはNotch2欠損リンパ球前駆細胞株にNotchシグナルを加えたときの遺伝子発現プロファイルをトランスクリプトーム解析により明らかにする。このデータをすでに取得済みのNotch1-ICおよびNotch2-ICのChIP-seqデータと統合的に解析する。
(B), 発生段階特異的にNotch1-ICおよびNotch2-ICに結合する分子群のプロテオミクス解析を行う。Notchシグナルが発生段階特異的にターゲット遺伝子を制御するメカニズムとして、ステージ特異的な転写因子と会合している可能性が考えられる。そこで、Notch1-ICおよびNotch2-ICにMycおよびFlagタグを付加したレトロウイルス発現ベクターを作製し、Notch-IC 会合分子のプロテオミクス解析を行う。
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