| 研究課題/領域番号 |
19K05747
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
どど 孝介 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 専任研究員 (20415243)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | アフィニティーラベリング / 蛍光イメージング / がん / 有機化学 |
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| 研究実績の概要 |
我々はリシン残基と選択的に反応するO-nitrobenzoxadiazole（O-NBD）を標識官能基として用い、生物活性化合物の結合蛋白質を蛍光標識する手法を開発している。O-NBDはコンパクトであるため元の化合物の生物活性に影響を与えず、さらにそれ自身は蛍光を持たないが、リシンと反応してN-NBDになると蛍光を発するというTurn-ON型の蛍光を持つ。本手法では蛍光標識が蛋白質に共有結合を介して導入されるため、サンプルを固定化しても蛍光標識が拡散することはなく、その蛍光が損なわれることはない。そこで本研究ではがん細胞に多く発現する受容体に着目し、そのリガンドにO-NBDユニットを導入することで、がん細胞特異的に共有結合を介してNBD標識を導入することで、固定処理にも対応できるがん蛍光イメージングプローブの開発を目指す。
本年度は特にがん細胞の成長に重要なビタミン類や補酵素などの受容体にフォーカスし、そのリガンドに対して各種リンカーとO-NBDを導入したプローブを開発することを計画した。既に報告されている受容体とリガンドのX線結晶構造解析を元にして、プローブと受容体の結合が維持されるようにO-NBDを導入する部位を決定し、さらに標識可能なリシン残基との距離を考慮して様々なリンカーの導入も計画した。各種リガンドを出発原料として種々条件検討を行ったところ、いくつかのO-NBDプローブを合成することに成功した。得られたプローブを標的とする受容体が過剰発現している培養細胞に処理したところ、標的受容体が発現すると考えられる細胞膜近傍が蛍光標識されることが確認できた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は標的とするリガンドの取り扱いに苦戦したところもあったが、何とか目的とするプローブの合成に成功した。さらに、蛍光ラベリングに関しても細胞で機能することが確認できたことから、研究は順調に進展していると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は蛍光標識されているタンパク質が標的とする受容体であるかどうかの確認を進め、標識されたリシン残基の同定と共に設計通りにO-NBDプローブが機能しているかを検証する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
蛍光プローブの合成や培養細胞を用いた蛍光標識実験に必要な試薬に関し、種々検討していく中でストックされている試薬で対応できたことから、新たに購入することなく研究を遂行できた。一方で蛍光イメージングなどに用いる機器類の不調などもいくつか見られたことから、次年度以降修理費などが発生する可能性も考えられたので、できるだけ予算を繰り越すことにした。次年度は各種消耗品の購入に加えて、適宜機器類のメンテナンス費用としての使用も計画する。
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