| 研究課題/領域番号 |
19K05747
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
どど 孝介 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 専任研究員 (20415243)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | アフィニティーラベリング / 蛍光イメージング / がん / 有機化学 |
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| 研究実績の概要 |
我々はリシン残基と選択的に反応するO-nitrobenzoxadiazole（O-NBD）を標識官能基として用い、生物活性化合物の結合蛋白質を蛍光標識する手法を開発している。O-NBDはコンパクトであるため元の化合物の生物活性に影響を与えず、さらにそれ自身は蛍光を持たないが、リシンと反応してN-NBDになると蛍光を発するというTurn-ON型の蛍光を持つ。本手法では蛍光標識が蛋白質に共有結合を介して導入されるため、サンプルを固定化しても蛍光標識が拡散することはなく、その蛍光が損なわれることはない。そこで本研究ではがん細胞に多く発現する蛋白質に着目し、そのリガンドにO-NBDユニットを導入することで、がん細胞特異的に共有結合を介してNBD標識を導入することで、固定処理にも対応できるがん蛍光イメージングプローブの開発を目指す。
昨年度はがん細胞の成長に重要なビタミン類や補酵素などの受容体リガンドにO-NBDを導入したプローブを合成し、蛍光標識化を検討したが優位な蛍光標識は見られなかった。そこで本年度はO-NBDとリンカーをつないだユニットを種々合成し、クリック反応を利用して一つの標的化合物から多数のO-NBDプローブを合成することを計画した。その結果、多様な長さ、物性を持つリンカーを導入可能なシステムの構築に成功した。しかしながら、本システムで合成したプローブを用いても標的蛋白質の蛍光標識化はできなかった。そこでその原因を精査したところ、標識化の前に標的タンパク質のエンドサイトーシスが起きてしまうことが明らかとなった。一方で標識効率が低いながらも、リンカーを変えることで狙った場所以外のリシン残基を蛍光標識可能なリガンドも見出すことができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度も標的とする受容体のリガンドに関して、狙いのリシン残基の蛍光標識はできなかった。しかしながら、その主な原因を明らかにすることには成功した。さらに種々のリンカーを導入する実験系を構築し、多数のリガンドを用いることで狙いとは異なる場所ではあるが標的タンパク質を蛍光標識することに成功した。
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| 今後の研究の推進方策 |
狙いとするタンパク質に関して標識化が起きにくい原因を明らかにすると共に、当初の計画とは異なるリシン残基を蛍光標識することには成功した。そこで今後はこれらの知見を糸口にして、狙いとするがん細胞の標的タンパク質を蛍光標識できるプローブの開発を目指す。また、昨年度見出した抗腫瘍活性天然物Rocaglamide Aを用いた蛍光標識化実験も検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初は最終年度として生物実験を中心に検討する予定であったが、コロナの影響もあり今年度は有機合成実験が中心となってしまった。そこで来年度に消耗品の予算を繰り越し、生物研究を進めることにした。また、機器類の不調などもいくつか見られたことから、必要に応じて修理費にも本予算を充てることを計画する。
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