| 研究実績の概要 |
TALENを用いたゲノム編集技術の活用により、T細胞レセプター(TCR)のα鎖とβ鎖のミスペアリングによる予期せぬ免疫反応のリスクを抑えるゲノム編集T細胞作出の検討を行った。内在性のTCRをノックアウトし目的の抗原特異的TCRをノックインする方法を確立し、作出した抗原特異的ゲノム編集T細胞の細胞障害活性をin vitroで検討した。
当初検討した方法は、in vitroでの抗原特異的な細胞傷害を確認できたが、細胞のviabilityが悪く、細胞のダメージ軽減のために遺伝子導入のステップ数を最小化した抗原特異的TCR導入T細胞の作成方法を検討することとなった。本方法では、TCRα鎖遺伝子およびβ鎖遺伝子を標的配列とする2組のTALEN mRNA(αTALENs, βTALENs)を合成・精製し、αTALENsの存在下にがん抗原特異的なTCR遺伝子をTCR α鎖遺伝子の所望領域に挿入可能なDNAベクターを作出した。第1段階で、βTALENs によりTCRβ遺伝子をノックアウトしたT細胞を樹立しておき、次いでα TALENsとTCR導入用ベクターをβ-KO T細胞に導入することにより、抗原特異的なTCRの発現が得られることの確認を試みた。作出したゲノム編集T細胞から抽出したcDNAを用いて、想定される結合部位の外側と内側にプライマーを設定しPCRで確認した所、Out-In PCR/In-Out PCRのいずれにおいても想定通りの 長さのバンドが得られ、ベクター上のがん抗原特異的TCR遺伝子がon targetでゲノムに導入されていることが確認できた。また、テトラマーにより遺伝子導入したTCRが発言していることを確認した。
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