| 研究課題/領域番号 |
19K10272
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| 研究機関 | 奈良県立医科大学 |
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研究代表者 |
桐田 忠昭 奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (70201465)
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| 研究分担者 |
仲川 洋介 奈良県立医科大学, 医学部, 助教 (00714875)
森 英一朗 奈良県立医科大学, 医学部, 准教授 (70803659)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | PIKKファミリー / ATR / ATR阻害剤 / 5-FU / 細胞周期 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、PIKKファミリーを中心としたDNA修復機構が、口腔がん治療を行う上での分子標的となりうるか否かの検討を進めている。これまでの研究で、p53の発現ステータスに関わらず、5-FUおよび温熱処理に対してはATR阻害剤が、X線照射に対してはDNA-PK阻害剤が、効率的なアポトーシスを誘導し殺細胞効果に著明な増感を示す結果となった。特に著明な増感を認めたATR阻害剤による5-FU増感効果に関するメカニズムの解明を進めており、ウエスタンブロッティングにて5-FUの濃度依存性にATRの自己リン酸化が強く進み、ATR阻害剤を加えることによりそれらのATRのリン酸化は抑制されることを確認している。また、γH2AX抗体を用いて免疫染色を行うことで、ATR阻害により5-FUによるDNA二本鎖切断を増加させ効率的なアポトーシスを誘導し増感効果をもたらすと考えられた。ATRは、DNA二本鎖切断の修復における相同組み換えでの修復中心的な役割を果たし、その修復は細胞周期のS/G2期に依存的であるため、細胞周期の変動や細胞周期に関わる遺伝子発現に変化を認めるか否かの解析を中心に本年度の研究を進めた。5-FUおよびATR阻害剤処理後の細胞周期の分布の解析とSub-G1によるアポトーシスの検出をフローサイトメトリーにて行った。5-FU処理により細胞周期がS期で停止していることが明らかとなり、5-FUとATR阻害剤の併用でSub-G1の割合が増加していることが明らかとなった。遺伝子発現変動に関して、RNA sequenceにて定性的に、qPCRにて定量的な遺伝子発現変動の解析を行った。32の有意な発現変動を認める遺伝子が検出され、細胞周期に関わる遺伝子は9種類であり、S期以降で細胞周期停止に働く傾向の遺伝子発現が認められた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
5-FU処理後の細胞内でのDNA修復応答は、PIKKファミリーのATRキナーゼを中心とした修復経路に活性が起こっている可能性が考えられ、これまでATR阻害剤と5-FU併用時にウエスタンブロッティングを用いてATRの発現と活性の変動やγH2AX抗体を用いて免疫染色による二本鎖切断量の変化に関して解析を進めてきた。さらに、フローサイトメトリーやRNA sequenceやqPCRなど分子生物学的解析手法を用いて細胞周期の変動やそれにかかわる遺伝子発現の変動について解明し、ATR阻害剤による5-FUの増感メカニズムが徐々に明らかにされていると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
プロテオミクス解析により、網羅的に経時的遺伝子発現の変動について解析を行いたいと考えている。また、DNA損傷部位のマーカーであるγH2AX抗体にリン酸化ATR抗体を組み合わせ、その共局在について免疫染色にて評価することにより、実際に損傷部位に対してATRがどのような位置関係をとるか検討する。さらにタイムラプスで経時的な、Zスタックにより立体的な観察をすることで、ATRの分子動態の詳細な観察が可能となると考える。また、それらフォーカスの局在位置を確認し、そこに細胞内核外輸送タンパク阻害剤を加えることにより、さらなる変化が認められるのかを検討していきたいと考えている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
COVID-19感染拡大により、参加を予定していた国内および国際学会が中止されたため、学会参加の準備費や旅費に当初予定額より減額を生じた。また、海外からの輸入試薬に関してはコロナ禍で納品時期が相当遅れる見込みのものがあり、消耗品に関しても世界情勢の影響を受けた供給不足により今年度の発注を見合わせたものがあった。これらの事情により、次年度への繰越金を生じた。
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